| |
Was ist Emission Fingerprinting?
Emission Fingerprinting ist ein innovatives Verfahren zur Registrierung, Analyse und Trennung von Emissionssignalen in Mehrfachfluoreszenz-experimenten. In einem 3-Stufen-Prozeß werden Farbstoffe selbst mit weit überlappenden Emissionsspektren, wie z.B. die Fluoreszenzproteine CFP, GFP und YFP sicher getrennt. Damit ermöglicht Emission Fingerprinting die Verwendung einer weitaus größeren Anzahl von Farbstoffen in einem Mehrfachfluoreszenzexperiment. Farbstoffe, die bisher in solchen Experimenten nicht identifizierbar waren, werden nunmehr mit einem Mausklick getrennt.
 | |
Emissionsspektren der Fluoreszenzproteine
CFP (blau), GFP (grün)
und YFP (rot), registriert
in Fluoreszenzprotein exprimierenden Zellen mit Hilfe der Funktion
Mean-of-ROI des LSM 710. |
| |
3 Schritte bis zum Ergebnis
Schritt 1:
Aufnahme eines Lambda Stacks (oder Serie)
 | | Sie erfassen zunächst die spektrale Signatur der Probe durch Aufnahme eines Lambda Stacks. |
| |
| Die schnelle, weil simultane Aufnahme von spektral aufgelösten Bildern garantiert hierbei die größtmögliche Schonung Ihrer empfindlichen Präparate. Gleichzeitig können mit ihr schnellste dynamische Prozesse sicher erfasst werden. |
| |
 |
| Der Lambda Stapel eines Drosophila Embryos zeigt die spektrale Verteilung des Emissionssignals der drei verschiedenen fluoreszierenden Marker. |
| |
Schritt 2:
Auswahl der Region of Interest (ROI)
Als nächstes bestimmen Sie im Unmixing View die Referenzspektren, entweder durch die Einzeichnung von Regionen oder durch die Nutzung der Automatischen Komponenten Analyse (ACE). Die resultierenden Spektren können für spätere Experimente in der Spektren Datenbank des LSM 710 gespeichert werden.
 |
Lamda Stapel dargestellt im Lamda-Coded Modus und mit relevanten
Regions of Interest (Haarkreuze). |
| |
 |
Spektrale Signaturen der Fluoreszenzen, ermittelt in den oben gezeigten
Regions of Interest. |
| |
Schritt 3:
Ausführen des Linear Unmixing
 | | Mit intelligenten Algorithmen trennt die Linear-Unmixing-Funktion die gemischten Signale Pixel für Pixel und nutzt dafür das gesamte Emissionsspektrum jedes einzelnen Farbstoffs in Ihrem Präparat. |
| |
Das Resultat ist die exakte Trennung auch stark überlappender Emissionsspektren, wie z.B. von GFP und FITC, oder die sichere Eliminierung von breitbandigen Autofluoreszenzen. Neue experimentelle Ansätze werden möglich, bisher stark autofluoreszierende Präparate können nun auch für Fluoreszenzmarkierungen genutzt werden.
 |
| Der entmischte Lambda Stapel zeigt die klar getrennten Signale der drei verschiedenen fluoreszierenden Marker. |
| |
| |
|