Décoder l'orientation des divisions cellulaires au cours du développement embryonnaire grâce à l'imagerie confocale Airyscan

La formation d'un embryon repose sur une succession de divisions cellulaires dont le positionnement et l'orientation participent directement à la construction des tissus. Lors des premières étapes du développement, ces divisions doivent être coordonnées avec précision pour permettre la mise en place d'une architecture cellulaire organisée et fonctionnelle.

L'équipe de Nicolas Minc à l'Institut Jacques Monod – CNRS s'intéresse aux mécanismes fondamentaux de la morphogenèse cellulaire et de la division. Dans le cadre de ces recherches, l'embryon d'oursin constitue un modèle particulièrement adapté pour comprendre comment le positionnement des structures intracellulaires accompagne la formation progressive de la blastula.

L'un des enjeux consiste notamment à déterminer comment se mettent en place les motifs de positionnement et d'orientation du fuseau mitotique et comment ceux-ci participent à l'établissement d'une monocouche cellulaire organisée autour du blastocèle.

Dans cette note d'application réalisée avec Aude Nommick, nous présentons l'utilisation du microscope confocal ZEISS LSM 980 équipé d'Airyscan 2 pour observer en trois dimensions des embryons d'oursin d'environ 100 µm de diamètre. Cette approche permet d'associer imagerie en profondeur et visualisation de structures intracellulaires fines, notamment les microtubules constituant le fuseau mitotique.

Les acquisitions obtenues ont permis une segmentation 3D précise de l'embryon et le suivi spatio-temporel de plusieurs composants intracellulaires. Elles ont notamment mis en évidence un déplacement progressif des noyaux et des centrosomes vers la surface de l'embryon au cours du développement. Ces observations contribuent à mieux comprendre les mécanismes biophysiques qui régulent l'orientation des divisions cellulaires et participent au maintien de l'architecture des tissus.

Dans cette note, découvrez :

• Comment l'embryon d'oursin permet d'étudier les mécanismes qui régulent l'orientation des divisions cellulaires et l'organisation des tissus.
• L'apport de l'imagerie confocale ZEISS LSM 980 avec Airyscan 2 pour observer en profondeur des embryons entiers et visualiser des structures intracellulaires fines.
• Comment l'imagerie 3D permet de suivre le positionnement des noyaux, des centrosomes et du fuseau mitotique au cours du développement embryonnaire.
  

Le développement embryonnaire repose sur une succession de divisions cellulaires coordonnées dans le temps et dans l'espace. Au cours de ces premières étapes, les cellules doivent non seulement se multiplier, mais également s'organiser afin de construire progressivement une architecture tissulaire cohérente.

La formation de la blastula représente une étape importante de ce processus. Elle résulte d'une série de divisions cellulaires stéréotypées et se caractérise par la formation d'une cavité remplie de liquide, le blastocèle, entourée d'une unique couche de cellules épithéliales constituant le blastoderme. La mise en place correcte de cette organisation est essentielle à la poursuite du développement embryonnaire.

L'orientation des divisions cellulaires précédentes semble jouer un rôle majeur dans la formation de cette structure. Pourtant, la manière dont les motifs de positionnement et d'orientation du fuseau mitotique apparaissent au cours du développement et contribuent à définir cette architecture en monocouche reste encore mal comprise.

Le projet mené au sein de l'équipe de Nicolas Minc vise ainsi à caractériser ces mécanismes en utilisant la blastula de l'embryon d'oursin comme modèle expérimental. L'objectif est de suivre l'évolution spatiale et temporelle de structures intracellulaires impliquées dans la division afin de mieux comprendre comment leur positionnement participe progressivement à l'organisation de l'embryon.

Les échantillons étudiés correspondent à des embryons d'oursin, préparés afin de visualiser simultanément plusieurs structures cellulaires impliquées dans leur organisation et leur division. Les embryons ont tout d'abord été fixés pendant 70 minutes à température ambiante dans un tampon FA contenant notamment du formaldéhyde et du glutaraldéhyde. Afin de réduire l'autofluorescence susceptible d'altérer la qualité des observations, ils ont ensuite été traités pendant 30 minutes avec une solution contenant du NaBH4.

Un protocole d'immunofluorescence a ensuite été appliqué. Les microtubules ont été marqués à l'aide de l'anticorps primaire DM1A, tandis que l'ADN a été révélé avec le Hoechst et l'actine avec la phalloïdine. Après les différentes étapes d'incubation et de lavage, les embryons ont été montés dans un milieu à base de glycérine puis recouverts d'une lamelle pour permettre leur observation.
L'imagerie a été réalisée avec un microscope confocal ZEISS LSM 980 équipé du module Airyscan 2 et d'un objectif 63× Oil. Les acquisitions ont été effectuées en mode Airyscan SR-4Y, sur trois canaux, avec une acquisition bidirectionnelle, sans moyennage et sous forme de Z-stacks couvrant le volume étudié.

L'un des principaux défis rencontrés lors de l'étude de l'embryon d'oursin réside dans ses dimensions. Avec un diamètre d'environ 100 µm, il est nécessaire d'obtenir un signal suffisamment intense en profondeur pour observer l'échantillon dans son volume, sans perdre les informations provenant des structures situées dans les plans les plus profonds.

À cette contrainte s'ajoute la nécessité de visualiser des structures particulièrement fines, comme les microtubules du fuseau mitotique. L'imagerie doit donc concilier profondeur d'observation, résolution, sensibilité et vitesse d'acquisition, tout en limitant le photoblanchiment.

L'utilisation du ZEISS LSM 980 avec Airyscan 2 a permis de répondre à ces différents besoins en fournissant le niveau de résolution nécessaire à l'observation des structures intracellulaires tout en conservant une capacité d'imagerie en profondeur.

La vitesse d'acquisition constitue également un avantage important pour ce projet, puisqu'elle permet d'acquérir un volume important d'images et de documenter les différentes étapes étudiées avec une qualité d'image adaptée à leur analyse.

La combinaison de ces performances a notamment permis :

• d'obtenir des données sur l'ensemble du volume étudié ;
• de distinguer des structures cytosquelettiques fines ;
• de suivre plusieurs composants intracellulaires en trois dimensions ;
• de réaliser une segmentation 3D précise de l'embryon ;
• et d'étudier leur comportement spatial et temporel au cours du développement.

L'imagerie Airyscan devient ainsi un outil permettant de relier l'observation de structures intracellulaires à l'organisation globale de l'embryon.

Les acquisitions réalisées ont permis d'obtenir une segmentation tridimensionnelle précise de l'embryon entier et de suivre en détail plusieurs composants intracellulaires au cours du développement.

L'analyse du comportement spatio-temporel des noyaux et du fuseau mitotique a notamment révélé une évolution de leur positionnement à mesure que l'embryon se développe. Les observations montrent que les noyaux et les centrosomes sont initialement bien centrés dans les cellules avant de subir progressivement un déplacement apical en direction de la surface de l'embryon.

Ces résultats apportent de nouvelles informations pour comprendre comment la position des structures impliquées dans la division cellulaire évolue au cours de la formation de la blastula et comment cette organisation peut contribuer à l'établissement de son architecture en monocouche.

Ils renforcent également l'intérêt de la blastula d'oursin comme modèle d'étude des mécanismes biophysiques régulant l'orientation de la division cellulaire et le maintien de l'architecture des tissus.

Comprendre comment les divisions cellulaires sont orientées au cours du développement est essentiel pour déterminer comment les cellules parviennent collectivement à construire et maintenir une architecture tissulaire organisée. L'étude de la blastula d'oursin permet d'aborder cette question à l'échelle de l'embryon entier tout en observant précisément les structures intracellulaires impliquées dans la division.

Dans ce contexte, l'utilisation du ZEISS LSM 980 associé à Airyscan 2 a permis de combiner imagerie en profondeur, résolution et rapidité d'acquisition afin d'obtenir des données tridimensionnelles détaillées. Le suivi des noyaux, des centrosomes et du fuseau mitotique met notamment en évidence leur repositionnement progressif au cours du développement et fournit de nouvelles informations sur les mécanismes participant à l'organisation de la blastula.

Cette approche contribue ainsi à mieux caractériser les mécanismes biophysiques qui contrôlent l'orientation des divisions cellulaires et le maintien de l'architecture des tissus, tout en renforçant l'intérêt de l'embryon d'oursin comme modèle pour l'étude fondamentale de la morphogenèse et de la division cellulaire