EM de volumen con microscopía electrónica de barrido con caras de bloque en serie
Técnicas de EM de volumen

SEM con caras de bloque en serie

Seccionamiento y captura de imágenes altamente automatizados de datos volumétricos

  • Preparación sencilla de muestras
  • Adquisición de imágenes altamente automatizada
  • Mayor resolución en el eje z que la tomografía de matriz
  • Magnífica resolución de las imágenes a baja tensión

EM de volumen con microscopio electrónico de barrido con caras de bloque en serie (SBF-SEM)

Con un ultramicrótomo situado en el interior de la cámara del microscopio electrónico de barrido, se puede capturar y cortar automáticamente una muestra embebida en resina hasta que se adquiere la pila deseada –o toda la pila– en la dirección Z de la muestra. El tamaño de paso z oscila entre 15 y 30 nm. La microscopía electrónica de barrido con caras de bloque en serie (SBF-SEM) es una tecnología que resulta idónea cuando el usuario quiere una preparación sencilla de la muestra, un proceso de captura de imágenes muy automatizado y una resolución en el eje z superior a la que se obtiene con la tomografía de matriz.

Con ZEISS Focal Charge Compensation, la técnica es más sólida y también puede utilizarse para muestras propensas a presentar carga, lo que antes solo era posible a expensas de la calidad de imagen: Una minúscula aguja capilar se coloca con precisión por encima de la muestra y el nitrógeno se guía a través de esta aguja directamente sobre la superficie de la cara de bloque mientras la cámara se mantiene en un alto vacío. Esto elimina la carga sin rebajar la calidad de imagen. Al disminuir la carga cuando se utiliza Focal Charge Compensation, se mejora la calidad de imagen y se reducen la desviación, la fluctuación y las distorsiones de la imagen. Estos últimos efectos eliminan la necesidad de un registro exhaustivo de los conjuntos de datos resultantes.

En general, Focal Charge Compensation permite captar imágenes de muestras más diversas en tres dimensiones sin carga y con alta resolución.

Representación esquemática de un flujo de trabajo típico

Captura de imágenes en SEM con caras de bloque en serie

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Una muestra incluida en resina se corta con un ultramicrótomo montado dentro de la cámara del SEM. Se capturan imágenes de la superficie expuesta de la muestra. Este procesos de corte y captura de imágenes se repite hasta que se consigue capturar una imagen completa de la estructura de interés.

Segmentación de procesamiento

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Las imágenes de microscopio electrónico adquiridas se procesan y alinean digitalmente en un conjunto de datos en 3D. Los compartimentos celulares se pueden identificar y segmentar.

Análisis de visualización en 3D

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El conjunto segmentado de datos en 3D se puede visualizar, investigar y analizar estadísticamente.

Ejemplos de aplicación

Comprender la relación entre la estructura y la función

Cerebro de ratón captado con ZEISS Sigma con ultramicrótomo integrado, pila de 75 imágenes con píxeles de 7 nm. Micrótomo ajustado para eliminar 15 nm/corte.
Cerebro de ratón captado con ZEISS Sigma con ultramicrótomo integrado, pila de 75 imágenes con píxeles de 7 nm. Micrótomo ajustado para eliminar 15 nm/corte.

Cerebro de ratón captado con ZEISS Sigma con ultramicrótomo integrado, pila de 75 imágenes con píxeles de 7 nm. Micrótomo ajustado para eliminar 15 nm/corte.

Cerebro de ratón captado con ZEISS Sigma con ultramicrótomo integrado, pila de 75 imágenes con píxeles de 7 nm. Micrótomo ajustado para eliminar 15 nm/corte.

Captura de imágenes de detalles ultraestructurales de neuronas

El cerebro es un órgano complejo con millones de conexiones neuronales y vías de señalización. Comprender la relación entre la estructura y la función del tejido cerebral ayuda a aclarar parte de esta complejidad para entender mejor cómo se organizan las redes neuronales y, a largo plazo, cómo tratar ciertas patologías con intervenciones médicas. 

Muestra de cara de bloques captada con 2,5 keV, intervalo de tiempo de píxel de 1 μs y alto vacío con el equipo Focal Charge Compensation. Barra de escala: 1 μm. Cortesía de NCMIR.
Muestra de cara de bloques captada con 2,5 keV, intervalo de tiempo de píxel de 1 μs y alto vacío con el equipo Focal Charge Compensation. Barra de escala: 1 μm. Cortesía de NCMIR.

Muestra de cara de bloques captada con 2,5 keV, intervalo de tiempo de píxel de 1 μs y alto vacío con el equipo Focal Charge Compensation. Barra de escala: 1 μm. Cortesía de NCMIR.

Muestra de cara de bloques captada con 2,5 keV, intervalo de tiempo de píxel de 1 μs y alto vacío con el equipo Focal Charge Compensation. Barra de escala: 1 μm. Cortesía de NCMIR.

Captura de imágenes de neuronas en cultivo celular

SBF-SEM es la solución adecuada para captar imágenes y seguir neuronas con protuberancias largas y delgadas, como las dendritas y los axones. Las neuronas en cultivo celular son especialmente difíciles de captar. La elevada proporción de resina no conductora hace que las muestras sean propensas a presentar carga. Focal Charge Compensation mitiga los efectos de carga y garantiza una elevada calidad de imagen. Los detalles ultraestructurales de las neuronas pueden visualizarse y determinarse fácilmente con la SBF-SEM en combinación con Focal Charge Compensation.

Las imágenes muestran un único corte de un conjunto de datos en 3D de un cultivo de neuronas del hipocampo que expresan PSD95-APEX2 para teñir las densidades postsinápticas (flechas). Las imágenes se adquirieron con un ZEISS FESEM, ultramicrótomo integrado y Focal Charge Compensation. La ultraestructura, como las dendritas finas y las conexiones, son visibles con alta resolución gracias a la eliminación de los efectos de carga.

Cortesía de Prof. Mark Ellisman (Universidad de California, San Diego, EE. UU.)

Neuronas individuales y compartimentos celulares en tejido cerebral de ratón

El vídeo muestra las secciones transversales de una muestra de cerebro de ratón captadas con SEM con caras de bloque en serie. La alta resolución que proporciona este enfoque puede observarse claramente en cada una de las imágenes de caras en bloque único. Las neuronas individuales y los compartimentos celulares pueden identificarse y seguirse a lo largo de la dimensión z.

Investigación de la mielinización de los axones para comprender la esclerosis múltiple y la enfermedad de Parkinson

  • Myelin lamellae
  • Single neurons and cellular compartments in mouse brain tissue​
  • Las micrografías electrónicas proporcionan información de alta resolución suficiente para contar el número de laminillas de mielina individuales y medir el grosor total de la vaina.
    Laminillas de mielina Cortesía de NCMIR.
    Cortesía de NCMIR.

    Cortesía de NCMIR.

    Las micrografías electrónicas proporcionan información de alta resolución suficiente para contar el número de laminillas de mielina individuales y medir el grosor total de la vaina.

    La naturaleza dispersa de las estructuras de estas muestras provoca importantes efectos de carga. El uso de Focal Charge Compensation elimina dichos efectos, gracias a lo que podrá capturar imágenes con la máxima resolución en las tres dimensiones.

  • Cortesía de NCMIR.

    La animación muestra una serie de cortes individuales (x-y) de médula espinal de rata mediante 3View® y Focal Charge Compensation. Las laminillas individuales dentro de las vainas de mielina de los axones son claramente visibles, así como los microtúbulos y otros orgánulos celulares

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