Microscopie électronique volumétrique avec microscopie électronique à balayage avec imagerie par coupes sériées
Techniques de microscopie électronique volumétrique

Imagerie MEB par coupes sériées

Sectionnement hautement automatisé et imagerie de données volumétriques

  • Préparation facile des échantillons
  • Acquisition hautement automatisée d'images
  • Résolution en Z supérieure à celle de la tomographie de réseau
  • Superbe résolution d'image à basse tension

Microscopie électronique volumétrique avec imagerie MEB par coupes sériées (SBF-MEB)

Avec un ultramicrotome situé à l'intérieur de la chambre du microscope électronique à balayage, un échantillon enrobé de résine peut être automatiquement imagé et coupé jusqu'à ce que la pile souhaitée (ou la pile entière) soit acquise dans la direction Z de l'échantillon. La taille du pas Z est comprise entre 15 et 30 nm. L'imagerie MEB par coupes sériées (SBF-MEB) est une technologie de choix lorsque l'utilisateur souhaite une préparation facile de l'échantillon, un processus d'imagerie hautement automatisé et une résolution Z plus élevée que celle obtenue avec la tomographie de réseau.

Avec ZEISS Focal Charge Compensation, la technique est plus solide et peut également être utilisée pour les échantillons sujets à la charge, ce qui n'était possible auparavant qu'au détriment de la qualité de l'image : une minuscule aiguille capillaire est placée avec précision au-dessus de l'échantillon et l'azote est guidé à travers cette aiguille directement sur la block-face tandis que la chambre est maintenue sous vide poussé. Cela permet d'éliminer la charge sans nuire à la qualité de l'image. En raison de la diminution de la charge lors de l'utilisation de la Focal Charge Compensation, la qualité de l'image est améliorée tout en réduisant la dérive, la gigue et les distorsions de l'image. Ces derniers effets éliminent la nécessité d'un enregistrement approfondi des ensembles de données résultants.

Dans l'ensemble, la Focal Charge Compensation permet d'imager des échantillons plus divers en trois dimensions sans charge et à haute résolution.

Représentation schématique d'un flux de tâches typique

Imagerie MEB par coupes sériées

1

Un échantillon enrobé de résine est découpé à l'aide d'un ultramicrotome monté à l'intérieur de la chambre du MEB. La surface exposée de l'échantillon est imagée. Ce processus de coupe et d'imagerie est répété jusqu'à ce que la structure d'intérêt soit complètement imagée.

Traitement de la segmentation

2

Les images acquises au microscope électronique sont traitées et alignées numériquement dans un ensemble de données 3D. Les compartiments cellulaires peuvent être identifiés et segmentés.

Analyse de la visualisation en 3D

3

L'ensemble des données 3D segmentées peut être visualisé, étudié et analysé statistiquement.

Exemples d'application

Comprendre la relation entre la structure et la fonction

Cerveau de souris imagé avec ZEISS Sigma avec ultramicrotome intégré, pile de 75 images avec des pixels de 7 nm. Microtome réglé pour enlever 15 nm/tranche.
Cerveau de souris imagé avec ZEISS Sigma avec ultramicrotome intégré, pile de 75 images avec des pixels de 7 nm. Microtome réglé pour enlever 15 nm/tranche.

Cerveau de souris imagé avec ZEISS Sigma avec ultramicrotome intégré, pile de 75 images avec des pixels de 7 nm. Microtome réglé pour enlever 15 nm/tranche.

Cerveau de souris imagé avec ZEISS Sigma avec ultramicrotome intégré, pile de 75 images avec des pixels de 7 nm. Microtome réglé pour enlever 15 nm/tranche.

Imagerie des détails ultrastructurels des neurones

Le cerveau est un organe complexe qui compte des millions de connexions neuronales et de voies de signalisation. Appréhender la relation entre la structure et la fonction du tissu cérébral permet d'élucider une partie de cette complexité afin de mieux comprendre l'organisation des réseaux neuronaux et, à long terme, de traiter certaines pathologies par des interventions médicales. 

Échantillon de block-face imagé à 2,5 keV, 1 μs pixel de temps d'attente et sous vide poussé à l'aide d'un appareil de Focal Charge Compensation. Barre d'échelle : 1 µm. Avec l'aimable autorisation de NCMIR.
Échantillon de block-face imagé à 2,5 keV, 1 μs pixel de temps d'attente et sous vide poussé à l'aide d'un appareil de Focal Charge Compensation. Barre d'échelle : 1 µm. Avec l'aimable autorisation de NCMIR.

Échantillon de block-face imagé à 2,5 keV, 1 μs pixel de temps d'attente et sous vide poussé à l'aide d'un appareil de Focal Charge Compensation. Barre d'échelle : 1 µm. Avec l'aimable autorisation de NCMIR.

Échantillon de block-face imagé à 2,5 keV, 1 μs pixel de temps d'attente et sous vide poussé à l'aide d'un appareil de Focal Charge Compensation. Barre d'échelle : 1 µm. Avec l'aimable autorisation de NCMIR.

Imagerie des neurones en culture cellulaire

Le SBF-MEB est la solution adaptée pour imager et suivre les neurones présentant des protubérances longues et fines, telles que les dendrites et les axones. Les neurones en culture cellulaire sont particulièrement difficiles à imager. La forte proportion de résine non conductrice rend les échantillons susceptibles de se charger. Focal Charge Compensation atténue les effets de charge et garantit une qualité d'image élevée. Les détails ultrastructurels des neurones peuvent être facilement imagés et résolus avec le SBF-MEB en combinaison avec Focal Charge Compensation.

Les images montrent une seule coupe d'un ensemble de données 3D de neurones hippocampiques cultivés exprimant PSD95-APEX2 pour colorer les densités post-synaptiques (flèches). Les images ont été acquises à l'aide d'un ZEISS FESEM, d'un ultramicrotome intégré et de Focal Charge Compensation. L'ultrastructure, comme les dendrites fines et les connexions, est visible avec une haute résolution grâce à l'élimination des effets de charge.

Avec l'aimable autorisation du Prof. Mark Ellisman (Université de Californie, San Diego)

Neurones uniques et compartiments cellulaires dans le tissu cérébral d'une souris

La vidéo montre les coupes transversales d'un échantillon de cerveau de souris capturées à l'aide d'une imagerie MEB par coupes sériées. La haute résolution offerte par cette approche peut être clairement observée dans chacune des images block-face. Les neurones et les compartiments cellulaires peuvent être identifiés et suivis le long de la dimension z.

Étude de la myélinisation des axones pour comprendre la sclérose en plaques et la maladie de Parkinson

  • Myelin lamellae
  • Single neurons and cellular compartments in mouse brain tissue​
  • Les micrographies électroniques fournissent des informations à haute résolution suffisantes pour compter le nombre de lamelles de myéline et mesurer l'épaisseur totale de la gaine.
    Lamelles de myéline Avec l'aimable autorisation de NCMIR.
    Avec l'aimable autorisation de NCMIR.

    Avec l'aimable autorisation de NCMIR.

    Les micrographies électroniques fournissent des informations à haute résolution suffisantes pour compter le nombre de lamelles de myéline et mesurer l'épaisseur totale de la gaine.

    La nature éparse des structures de ces échantillons entraîne des effets de charge significatifs. L'utilisation de Focal Charge Compensation élimine ces effets, vous permettant désormais de capturer des images avec la plus haute résolution dans les trois dimensions.

  • Avec l'aimable autorisation de NCMIR.

    L'animation montre un parcours de coupes simples (x-y) de la moelle épinière de rat en utilisant 3View® et Focal Charge Compensation. Les lamelles individuelles des gaines de myéline des axones sont clairement visibles, de même que les microtubules et d'autres organites cellulaires

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