シリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡法を用いたボリュームEM
ボリュームEMのテクニック

シリアルブロックフェイスSEM

高度に自動化されたセクショニングとボリュームイメージング

  • 試料調製が容易
  • 高度な自動画像取得
  • Array Tomographyよりも高いZ分解能
  • 低加速電圧でも優れた画像解像度

シリアルブロックフェイスSEM(SBF-SEM)を用いたボリュームEM

樹脂包埋試料は、SEMチャンバー内に配置されたウルトラミクロトームを使用して目的の、または全体のスタックが得られるまでZ方向に切断し、自動でイメージングできます。Zステップサイズは、15~30 nmの範囲です。シリアルブロックフェイスSEM(SBF-SEM)は、容易な試料調製、高度な自動イメージングプロセス、Array Tomographyよりも高いZ分解能を求めるユーザーに最適なテクノロジーです。

ZEISS Focal Charge Compensationを用いることでこのテクニックがよりロバストになり、これまで画質を犠牲にしないと実現不可能だった帯電しやすい試料にも使用できます。極小のキャピラリー針を試料の上に高精度で配置し、チャンバー内を高真空に保ったまま、この針から窒素をブロックフェース表面に直接誘導します。これにより、画質を低下させることなく帯電が除去されます。Focal Charge Compensationを使用している間に帯電が減るので、画質が向上し、ドリフトやジッター、画像の歪みが低減します。このような効果により、取得したデータを広範に登録する必要がなくなります。

全体として、Focal Charge Compensationにより、さらに多様な試料を帯電なく高分解能で3Dイメージングすることが可能となります。

典型的なワークフローの略図

シリアルブロックフェイスSEMイメージング

1

SEMチャンバー内に設置されたウルトラミクロトームを使用して、樹脂包埋試料を切断します。露出した試料表面をイメージングします。この切断とイメージングのプロセスを、目的の構造が完全にイメージングできるまで繰り返し行います。

セグメンテーションの処理

2

取得した電子顕微鏡画像は処理され、デジタルで3Dデータセットに調整されます。細胞コンパートメントは特定し、セグメント化することができます。

3Dビジュアライゼーション解析

3

セグメント化された3Dデータセットは、視覚化および調査を行い、統計的に分析することができます。

アプリケーション例

構造と機能との関係を理解する

ウルトラミクロトームを内蔵するZEISS Sigmaを使用して、7 nmピクセル、75枚の画像スタックでイメージングされたマウスの脳。15 nmの切片を切るよう設定されたミクロトーム。
ウルトラミクロトームを内蔵するZEISS Sigmaを使用して、7 nmピクセル、75枚の画像スタックでイメージングされたマウスの脳。15 nmの切片を切るよう設定されたミクロトーム。

ウルトラミクロトームを内蔵するZEISS Sigmaを使用して、7 nmピクセル、75枚の画像スタックでイメージングされたマウスの脳。15 nmの切片を切るよう設定されたミクロトーム。

ウルトラミクロトームを内蔵するZEISS Sigmaを使用して、7 nmピクセル、75枚の画像スタックでイメージングされたマウスの脳。15 nmの切片を切るよう設定されたミクロトーム。

ニューロンにおける超微細構造の詳細なイメージング

脳は、数百万の神経結合とシグナル伝達経路を有する複雑な器官です。脳組織の構造と機能との関係を理解することは、この複雑さを部分的に解明するのに役立ち、神経回路網の働きと統率を深く理解することにつながり、長期的には一部の疾患の医療介入による治療法の解明にも役立ちます。 

Focal Charge Compensation装置を使用して、2.5 keV、画素滞在時間1 μsピクセル、高真空でイメージングしたブロックフェース試料。スケールバー:1 µmご提供:NCMIR
Focal Charge Compensation装置を使用して、2.5 keV、画素滞在時間1 μsピクセル、高真空でイメージングしたブロックフェース試料。スケールバー:1 µmご提供:NCMIR

Focal Charge Compensation装置を使用して、2.5 keV、画素滞在時間1 μsピクセル、高真空でイメージングしたブロックフェース試料。スケールバー:1 µmご提供:NCMIR

Focal Charge Compensation装置を使用して、2.5 keV、画素滞在時間1 μsピクセル、高真空でイメージングしたブロックフェース試料。スケールバー:1 µmご提供:NCMIR

細胞培養中のニューロンのイメージング

SBF-SEMは、樹状突起や軸索など、神経細胞における細長く突出した構造を、連続的にイメージングするのに最適なソリューションです。細胞培養中のニューロンのイメージングは特に困難です。非導電樹脂の割合が高いため、試料が帯電しやすくなります。Focal Charge Compensationはチャージアップを低減し、高画質を実現します。SBF-SEMとFocal Charge Compensationとを組み合わせることで、ニューロンにおける超微細構造の細部も容易に分解およびイメージングできます。

これらの画像は、シナプス後膜肥厚(矢印)を染色したPSD95-APEX2を示す、培養された海馬ニューロンの3Dデータの単独スライスです。画像はZEISS FESEM、内蔵ウルトラミクロトーム、Focal Charge Compensationを使用し、取得しています。チャージアップの除去によって生じた高分解能により、薄い樹状突起や結合などの超微細構造が視認できます。

ご提供:Prof. Mark Ellisman(University of California, San Diego)

マウス脳組織内の単独のニューロンと細胞コンパートメント

この動画は、シリアルブロックフェイスSEMを用いて取得したマウスにおける脳試料の断面を表しています。このアプローチで得られる高分解能は、各ブロックフェース画像で明瞭に確認することができます。Z方向に並んでいる単独のニューロン、および細胞コンパートメントが特定できます。

複数の硬化症とパーキンソン病を理解するための軸索の髄鞘形成の研究

  • Myelin lamellae
  • Single neurons and cellular compartments in mouse brain tissue​
  • 電子顕微鏡写真は、単独のミエリン層板を計数し、鞘の厚さを測定するのに十分な高分解能情報をもたらします。
    ミエリン層板 ご提供:NCMIR
    ご提供:NCMIR

    ご提供:NCMIR

    電子顕微鏡写真は、単独のミエリン層板を計数し、鞘の厚さを測定するのに十分な高分解能情報をもたらします。

    これらの試料では構造がまばらなため、チャージアップが増大します。Focal Charge Compensationを使用するとこのような影響がなくなるため、3方向すべてにおいて最高分解能でイメージングすることができます。

  • ご提供:NCMIR

    この動画は、3View®およびFocal Charge Compensationを使用した、ラット脊髄の単独切片(X-Y)のランを示しています。軸索のミエリン鞘内の単独層と、微小管や他の細胞オルガネラが明瞭に視認できます

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