クライオFIB-SEMのアプリケーション
ご提供:P. Munro and H. Armer, UCL - Institute of Ophthalmology, London, UK Courtesy of P. Munro and H. Armer, UCL - Institute of Ophthalmology, London, UK.
概要

シリアルブロックフェイスSEM

革新的な事例を見る

シリアルブロックフェイス走査型電子顕微鏡(SBF-SEM)では、SEMチャンバー内部のウルトラミクロトームを使用して、樹脂包埋された生体試料の超微細構造を広範囲に渡り、3Dでイメージングします。

ダイアモンドナイフで試料ブロックから切片をスライスし、電子ビームと後方散乱電子検出器により露出した試料表面をイメージングします。目的の、または全体のスタックが得られるまで、試料のZ方向に切断とイメージングのプロセスを自動で繰り返し行います。

個々の2D画像をスティッチングして並べ、試料の3Dボリュームを作成します。

脳内の神経結合と神経細胞の形態を理解する

脳は、数百万の神経結合とシグナル伝達経路を有する複雑な器官です。脳組織の構造と機能との関係を理解することは、この複雑さを部分的に解明するのに役立ち、神経回路網の働きと統率を深く理解することにつながり、長期的には一部の疾患の医療介入による治療法の解明にも役立ちます。SBF-SEMは、樹状突起や軸索など、神経細胞の細長く突出した構造を連続的にイメージングするのに最適なソリューションです。

この動画は、SBF-SEMを用いて取得したマウスの脳試料の断面を表しています。このアプローチで達成された高分解能は、各ブロックフェース画像で明瞭に確認でき、異なる構造の識別に有用です。ご提供:Prof. Mark Ellisman, University of California, San Diego, USA

樹脂包埋され、その後BSE検出器およびSBF装置を用いてイメージングされたマウスの脳のスタック。

樹脂包埋され、その後BSE検出器およびSBF装置を用いてイメージングされたマウスの脳のスタック。

樹脂包埋され、その後BSE検出器およびSBF装置を用いてイメージングされたマウスの脳のスタック。

樹脂包埋され、その後BSE検出器およびSBF装置を用いてイメージングされたマウスの脳のスタック。

樹脂包埋され、その後BSE検出器およびSBF装置を用いてイメージングされたマウスの脳のスタック。

この画像は、高分解能3Dボリュームを生成する自動ランの一部として、樹脂包埋され、その後BSE検出器およびSBF装置を用いてイメージングされたマウスの脳のスタックを示しています。 ご提供:Naomi Kamasawa, Max Planck Florida Institute, R. Shigemoto, Nation Institute for Physiological Sciences Okazaki, Japan

このアニメーションは、脳組織の3Dデータから取得した単独切片(X-Y)のランを示しています。3Dボリュームが完全に再構成されているので、直接イメージングしなかった平面(X-Z、Y-Z)のビジュアライゼーションも可能です。7 nmピクセル、切片厚さ15 nmで、合計75枚の画像を取得しました。ご提供:Naomi Kamasawa – Max Planck Florida Institute, Jupiter, USA, and Ryuichi Shigemoto – National Institute for Physiological Sciences Okazaki, Japan

Z方向に並んでいる単独のニューロンと細胞コンパートメントが容易に特定できます。

マウス脳

マウス脳

マウス脳

神経生物学的試料の神経回路網とシナプスの観察

SBF-SEMでは高分解能3Dイメージングにより、このマウス脳などの試料がイメージングでき、単独のニューロンと細胞コンパートメントを観察できます。この試料は、SBF-SEMと15 nmの切片を切るよう設定されたミクロトームを使用して、7 nmピクセルの画像スタック75枚をイメージングしたものです。

マウスの脳(シナプス後膜肥厚を染色しPSD95-APEX2を発現、培養した海馬のニューロン)

マウスの脳(シナプス後膜肥厚を染色しPSD95-APEX2を発現、培養した海馬のニューロン)

マウスの脳(シナプス後膜肥厚を染色しPSD95-APEX2を発現、培養した海馬のニューロン)

神経の形態と神経回路網を理解するために、培養した海馬のニューロンを観察する

神経の形態と神経回路網の基本を理解するために重要なのは、樹状突起や軸索、細胞突起、神経細胞間の結合などの特徴を高分解能でイメージングすることです。
これらの画像は、シナプス後膜肥厚(矢印)を染色したPSD95-APEX2を示す、培養された海馬ニューロンの3Dデータセットの単独スライスです。画像は、SBF-SEMとFocal Charge Compensationを使用して取得したものです。チャージアップの除去によって生じた高分解能により、薄い樹状突起や結合などの超微細構造が視認できます。ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research NCMIR, University of California, San Diego, USA

複数の硬化症とパーキンソン病を理解するための軸索の髄鞘形成の研究

複数の硬化症やパーキンソン病等の疾患においては、軸索の髄鞘形成に変化が生じます。電子顕微鏡写真は、単独のミエリン層板を計数し、鞘の厚さを測定するのに十分な高分解能情報をもたらします。これらの試料では構造がまばらなため、非伝導のベア樹脂の領域が大きく、チャージアップが増大します。Focal Charge Compensationを使用するとこのような影響がなくなるので、3方向すべてにおいて最高分解能でイメージングすることができます。

ライフサイエンス試料をSEMでイメージングする際に画質が大きく低下すると、チャージアップが大きな問題になる可能性があります。Focal Charge Compensationを使用せずに、このラットの軸索束を高真空でイメージングした場合、チャージアップが明確に見られます。対照的に、Focal Charge Compensation使用して画像を取得した場合、ベア樹脂が大きく広がっていても、チャージアップは見られません。これらの画像は、約300ミクロン径の軸索束を異なる倍率で示しています(ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA)。

  • Focal Charge Compensationを使用せず、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが明確に視認できます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA
  • Focal Charge Compensationを使用して、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが低減されます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA
  • Focal Charge Compensationを使用して、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが低減されます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

    Focal Charge Compensationを使用して、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが低減されます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

  • Focal Charge Compensationを使用して、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが低減されます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

    Focal Charge Compensationを使用して、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが低減されます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

  • Focal Charge Compensationを使用せず、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが明確に視認できます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

    Focal Charge Compensationを使用せず、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが明確に視認できます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

    Focal Charge Compensationを使用せず、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが明確に視認できます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

    Focal Charge Compensationを使用せず、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが明確に視認できます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

    Focal Charge Compensationを使用せず、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが明確に視認できます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

  • Focal Charge Compensationを使用して、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが低減されます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

    Focal Charge Compensationを使用して、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが低減されます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

  • Focal Charge Compensationを使用して、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが低減されます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

    Focal Charge Compensationを使用して、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが低減されます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

  • Focal Charge Compensationを使用して、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが低減されます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

    Focal Charge Compensationを使用して、SEMにより高真空でイメージングされたラットの軸索束。チャージアップが低減されます。画像ご提供:National Center for Microscopy and Imaging Research(NCMIR), University of California, San Diego, USA

このアニメーションは、SBFとFocal Charge Compensationを使用した、ラット脊髄の単独切片(X-Y)のランを示しています。オリジナルデータセットにおいて、軸索のミエリン鞘内の単独層と、微小管や他の細胞オルガネラが明確に視認できます。

ミエリン層板

ミエリン層板

ミエリン層板

ミエリン層板

ミエリン層板

このSBF-SEM画像は、単独のミエリン層板を計数し、鞘の厚さを測定するのに十分な高分解能情報をもたらします。Focal Charge Compensationを使用して取得された画像では、ベア樹脂が大きく広がっていても、チャージアップが見られません。

脳の試料における星状膠細胞の特定

星状膠細胞がマーキングされた脳の試料

この脳の試料は、SBF-SEMを用いてイメージングされたものです。星状膠細胞(turquoise)が容易に特定され、3Dで視覚化およびセグメンテーションされています。ご提供:P. Munro and H. Armer, UCL - Institute of Ophthalmology, London, UK

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