Anwendungen für die Kryo-FIB-SEM — Mit freundlicher Genehmigung von P. Munro und H. Armer, UCL – Institute of Ophthalmology, London, Vereinigtes Königreich. Courtesy of P. Munro and H. Armer, UCL - Institute of Ophthalmology, London, UK.

Übersicht

Serial-Blockface-SEM

Inspirierende Beispiele

Bei der Serial-Blockface-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) kommt in der SEM-Kammer ein Ultramikrotom zum Einsatz. Auf diese Weise kann die Ultrastruktur einer in Harz eingebetteten biologischen Probe über einen großen Bereich in 3D abgebildet werden.

Das Diamantmesser schneidet Schnitte vom Probenblock ab – im Anschluss wird die freigelegte Probenfläche mit dem Elektronenstrahl und einem Rückstreuelektronendetektor aufgenommen. Der Schnitt- und Bildgebungsprozess wird so lange wiederholt, bis die gewünschten – oder alle – Ebenen in Z-Richtung der Probe aufgenommen wurden.

Die einzelnen 2D-Bilder werden zu einem 3D-Volumen der Probe zusammengefügt und ausgerichtet.

Neuronale Verbindungen im Gehirn und Morphologie von Nervenzellen

Das Gehirn ist ein komplexes Organ mit Millionen von neuronalen Verbindungen und Signalwegen. Um langfristig neue Behandlungsmöglichkeiten für bestimmte Pathologien des Gehirns zu finden, müssen Forschende dieses vielschichtige Netzwerk aus Neuronen und seinen Aufbau besser verstehen und genauer bestimmen. Dies erfordert ein besseres Verständnis der Zusammenhänge zwischen Struktur und Funktion des Hirngewebes. SBF-SEM ist eine ideale Lösung für die Bildgebung und Verfolgung von Neuronen mit langen, dünnen Fortsätzen, wie etwa Dendriten und Axonen.

Das Video zeigt Querschnitte aus der Probe eines Mäusehirns, die mit SBF-SEM aufgenommen wurden. Die hohe Auflösung dieses Verfahrens ist dabei klar erkennbar: Die verschiedenen Strukturen lassen sich auf jedem einzelnen Blockface-Bild eindeutig identifizieren. Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Mark Ellisman, University of California, San Diego, USA.

Ebenen eines in Harz eingebetteten Mäusehirns, die mit einem BSE-Detektor und einem SBF-System abgebildet wurden.

Dieses Bild zeigt Ebenen eines in Harz eingebetteten Mäusehirns, die automatisiert mit einem BSE-Detektor und einem SBF-SEM-System abgebildet wurden, um ein hochaufgelöstes 3D-Volumen zu erstellen. Mit freundlicher Genehmigung von Naomi Kamasawa, Max Planck Florida Institute, USA, und R. Shigemoto, National Institute for Physiological Sciences Okazaki, Japan.

Die Animation zeigt einen Durchlauf durch einzelne Schnitte (x–y) aus einem 3D-Datensatz einer Hirngewebeprobe. Das 3D-Volumen wurde vollständig rekonstruiert. Deshalb lassen sich auch Ebenen visualisieren, die nicht direkt abgebildet wurden (x–z, y–z). Insgesamt wurden 75 Bilder mit einer Pixelgröße von 7 nm und einer Schnittdicke von 15 nm aufgenommen. Mit freundlicher Genehmigung von Naomi Kamasawa vom Max Planck Florida Institute, Jupiter, USA und Ryuichi Shigemoto vom National Institute for Physiological Sciences Okazaki, Japan.

Einzelne Neuronen und Zellkompartimente lassen sich schnell und einfach identifizieren und in Z-Richtung verfolgen.

Untersuchung des neuronalen Netzes und der Synapsen in neurobiologischen Proben

Die SBF-SEM ermöglicht 3D-Bildgebung in hoher Auflösung und kann daher bei Proben wie diesem Mäusehirn sogar einzelne Neuronen und zelluläre Kompartimente sichtbar machen. Diese Probe wurde mittels SBF-SEM anhand von 75 Ebenenaufnahmen mit einer Pixelgröße von 7 nm aufgenommen. Das Mikrotom war dabei auf einen Abtrag von 15 nm/Schnitt eingestellt.

Mäusehirn (kultivierte Nervenzellen aus dem Hippocampus, die PSD95-APEX2 zur Färbung der postsynaptischen Dichte exprimieren)

Untersuchung kultivierter Nervenzellen aus dem Hippocampus zur Erforschung neuronaler Morphologien und Netzwerke

Die hochaufgelöste Bildgebung von Merkmalen wie dünnen Dendriten, Axonen, Zellausstülpungen und Verbindungen zwischen einzelnen Neuronen ist der Schlüssel zum grundlegenden Verständnis neuronaler Morphologien und Netzwerke.
Die Bilder zeigen einen einzelnen Schnitt aus einem 3D-Datensatz kultivierter Nervenzellen aus dem Hippocampus, die PSD95-APEX2 zur Färbung der postsynaptischen Dichte exprimieren (Pfeile). Das Bild wurde mittels SBF-SEM mit Focal Charge Compensation (fokale Ladungskompensation) aufgenommen. Durch die Beseitigung von Aufladungseffekten wird die Ultrastruktur, darunter dünne Dendriten und Verbindungen, in hoher Auflösung sichtbar. Mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.

Untersuchung der Axon-Myelinisierung zur Erforschung von multipler Sklerose und Morbus Parkinson

Bei Erkrankungen wie multipler Sklerose und Morbus Parkinson sind Veränderung bei der Myelinisierung von Nervenaxonen zu beobachten. Elektronenmikroskopische Gefügebilder liefern Informationen in hoher Auflösung, in denen sich die Anzahl der einzelnen Myelinlamellen zählen und die Gesamtdicke der Myelinscheide messen lässt. Angesichts der spärlichen Strukturen in diesen Proben sind große Bereiche mit nicht leitendem, reinem Harz gefüllt, wodurch erhebliche Aufladungseffekte entstehen. Focal Charge Compensation beseitigt diese Effekte – so erhalten Sie Bilder in höchstmöglicher Auflösung in allen drei Richtungen.

Aufladungseffekte können bei der Bildgebung biowissenschaftlicher Proben mittels SEM erhebliche Probleme verursachen, denn sie verringern die Bildqualität beträchtlich. Diese Aufnahmen eines Axonbündels einer Ratte im Hochvakuum ohne fokale Ladungskompensation zeigen deutliche Aufladungseffekte. Werden die Bilder dagegen mit Focal Charge Compensation aufgenommen, sind keine Aufladungseffekte sichtbar, auch nicht in den großen Bereichen mit reinem Harz. Die Bilder zeigen ein Axonbündel mit einem Durchmesser von rund 300 µm in verschiedenen Vergrößerungen (mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research [NCMIR], University of California, San Diego, USA).

Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM mit Focal Charge Compensation. Aufladungseffekte sind kaum wahrnehmbar. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.
Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM mit Focal Charge Compensation. Aufladungseffekte sind kaum wahrnehmbar. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.

Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM ohne Focal Charge Compensation. Aufladungseffekte sind deutlich sichtbar. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.

Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM ohne Focal Charge Compensation. Aufladungseffekte sind deutlich sichtbar. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.

Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM ohne Focal Charge Compensation. Aufladungseffekte sind deutlich sichtbar. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.
Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM mit Focal Charge Compensation. Aufladungseffekte sind kaum wahrnehmbar. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.
Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM mit Focal Charge Compensation. Aufladungseffekte sind kaum wahrnehmbar. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.
Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM mit Focal Charge Compensation. Aufladungseffekte sind kaum wahrnehmbar. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.

Die Animation zeigt einen Durchlauf durch einzelne Schnitte (x–y) des Rückenmarks einer Ratte mit SBF und Focal Charge Compensation. Einzelne Lamellen in den Myelinscheiden der Axone sind deutlich sichtbar, ebenso wie Mikrotubuli und andere Zellorganellen im Originaldatensatz.

Diese SBF-SEM-Aufnahme liefert hochaufgelöste Informationen, die es ermöglichen, die Anzahl der einzelnen Myelinlamellen zu zählen und die Gesamtdicke der Myelinscheide zu messen. Die mit Focal Charge Compensation aufgenommenen Bilder zeigen keine Aufladungseffekte, auch nicht in den großen Bereichen mit reinem Harz.

Identifizierung von Astrozyten in einer Hirnprobe

Diese Probe wurde mit SBF-SEM abgebildet. Astrozyten (türkis) lassen sich schnell und einfach identifizieren, visualisieren und in 3D segmentieren. Mit freundlicher Genehmigung von P. Munro und H. Armer, UCL – Institute of Ophthalmology, London, Vereinigtes Königreich.