Anwendungen für die Kryo-FIB-SEM — Mit freundlicher Genehmigung von P. Munro und H. Armer, UCL – Institute of Ophthalmology, London, Vereinigtes Königreich. Courtesy of P. Munro and H. Armer, UCL - Institute of Ophthalmology, London, UK.

Übersicht

Serial-Blockface-SEM

Inspirierende Beispiele entdecken

Die Serial-Blockface-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-SEM) arbeitet mit einem Ultramikrotom in der SEM-Kammer. Damit wird die Ultrastruktur einer in Harz eingebetteten biologischen Probe über einen großen Bereich in 3D abgebildet.

Ein Diamantmesser schneidet Schnitte vom Probenblock ab und die freigelegte Probenfläche wird mit dem Elektronenstrahl und einem Rückstreuelektronendetektor aufgenommen. Der Schnitt- und Bildgebungsprozess wird so lange wiederholt, bis die gewünschten – oder alle – Ebenen in Z-Richtung der Probe aufgenommen wurden.

Die einzelnen 2D-Bilder werden zu einem 3D-Volumen der Probe zusammengefügt und ausgerichtet.

Neuronale Verbindungen im Gehirn und Morphologie von Nervenzellen

Das Gehirn ist ein komplexes Organ mit Millionen von neuronalen Verbindungen und Signalwegen. Mit einem besseren Verständnis des Zusammenhangs zwischen Struktur und Funktion des Hirngewebes lässt sich diese Komplexität genauer bestimmen. So lässt sich leichter nachvollziehen, wie neuronale Netze aufgebaut sind und wie (auf lange Sicht) bestimmte Pathologien mit medizinischen Interventionen behandelt werden können. SBF-SEM ist eine ideale Lösung für die Bildgebung und Verfolgung von Neuronen mit langen, dünnen Fortsätzen, wie etwa Dendriten und Axonen.

Das Video zeigt Querschnitte aus der Probe eines Mäusehirns, die mit SBF-SEM aufgenommen wurden. Die hohe Auflösung dieses Verfahrens ist dabei klar erkennbar: Die verschiedenen Strukturen lassen sich auf jedem einzelnen Blockface-Bild eindeutig identifizieren. Mit freundlicher Genehmigung von Prof. Mark Ellisman, University of California, San Diego, USA.

Ebenen eines Mäusehirns, die in Harz eingebettet und dann mit einem BSE-Detektor und einem SBF-System abgebildet wurden.

Dieses Bild zeigt Ebenen eines Mäusehirns, die in Harz eingebettet und dann im Rahmen eines automatisierten Durchlaufs mit einem BSE-Detektor und einem SBF-SEM-System abgebildet wurden, um ein hochaufgelöstes 3D-Volumen zu erstellen. Mit freundlicher Genehmigung von Naomi Kamasawa, Max Planck Florida Institute, R. Shigemoto, National Institute for Physiological Sciences Okazaki, Japan.

Die Animation zeigt einen Durchlauf durch einzelne Schnitte (x–y) aus einem 3D-Datensatz von Hirngewebe. Das 3D-Volumen wurde vollständig rekonstruiert. Deshalb lassen sich auch Ebenen visualisieren, die nicht direkt abgebildet wurden (x–z, y–z). Insgesamt wurden 75 Bilder mit 7 nm Pixelgröße und 15 nm Schnittdicke aufgenommen. Mit freundlicher Genehmigung von Naomi Kamasawa vom Max Planck Florida Institute, Jupiter, USA und Ryuichi Shigemoto vom National Institute for Physiological Sciences Okazaki, Japan.

Einzelne Neuronen und Zellkompartimente lassen sich schnell und einfach identifizieren und in Z-Richtung verfolgen.

Untersuchung des neuronalen Netzes und der Synapsen in neurobiologischen Proben

SBF-SEM ermöglicht die hochaufgelöste 3D-Bildgebung und kann daher bei Proben wie diesem Mäusehirn einzelne Neuronen und zelluläre Kompartimente sichtbar machen. Diese Probe wurde mittels SBF-SEM anhand von 75 Ebenenaufnahmen mit 7 nm Pixelgröße aufgenommen. Das Mikrotom war dabei auf das Entfernen von 15 nm/Schnitt eingestellt.

Mäusehirn (kultivierte Nervenzellen aus dem Hippocampus, die PSD95-APEX2 zur Färbung der postsynaptischen Dichte exprimieren)

Untersuchung kultivierter Nervenzellen aus dem Hippocampus mit Blick auf neuronale Morphologien und Netze

Die hochaufgelöste Bildgebung von Merkmalen wie dünnen Dendriten, Axonen, Zellausstülpungen und Verbindungen zwischen einzelnen Neuronen ist der Schlüssel zum grundlegenden Verständnis neuronaler Morphologien und Netze.
Die Bilder zeigen einen einzelnen Schnitt aus einem 3D-Datensatz kultivierter Nervenzellen aus dem Hippocampus, die PSD95-APEX2 zur Färbung der postsynaptischen Dichte exprimieren (Pfeile). Das Bild wurde mittels SBF-SEM und Focal Charge Compensation (fokale Ladungskompensation) aufgenommen. Die Ultrastruktur wie dünne Dendriten und Verbindungen sind bei hoher Auflösung sichtbar, da Aufladungseffekte beseitigt wurden. Mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.

Untersuchung der Axon-Myelinisierung mit Blick auf Multiple Sklerose und Parkinson-Krankheit

Die Axon-Myelinisierung ist bei Erkrankungen wie Multipler Sklerose und Parkinson-Krankheit verändert. Elektronenmikroskopische Gefügebilder liefern Informationen in hoher Auflösung, mit denen sich die Anzahl der einzelnen Myelinlamellen zählen und die Gesamtdicke der Myelinscheide messen lässt. Angesichts der spärlichen Strukturen in diesen Proben sind große Bereiche mit nicht leitendem, reinem Harz gefüllt, wodurch erhebliche Aufladungseffekte entstehen. Focal Charge Compensation (fokale Ladungskompensation) beseitigt diese Effekte – so erhalten Sie Bilder in höchstmöglicher Auflösung in allen drei Dimensionen.

Aufladungseffekte können bei der Bildgebung biowissenschaftlicher Proben mittels SEM erhebliche Probleme verursachen, denn sie verringern die Bildqualität beträchtlich. Die Aufnahmen dieses Axonbündels einer Ratte im Hochvakuum ohne fokale Ladungskompensation zeigen deutliche Aufladungseffekte. Werden die Bilder dagegen mit Focal Charge Compensation aufgenommen, sind keine Aufladungseffekte sichtbar, auch nicht in den großen Bereichen mit reinem Harz. Die Bilder zeigen ein Axonbündel mit einem Durchmesser von rund 300 µm in verschiedenen Vergrößerungen (mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research [NCMIR], University of California, San Diego, USA).

Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM mit Focal Charge Compensation. Die Aufladungseffekte sind abgeschwächt. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.
Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM mit Focal Charge Compensation. Die Aufladungseffekte sind abgeschwächt. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.

Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM ohne Focal Charge Compensation. Aufladungseffekte sind deutlich sichtbar. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.

Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM ohne Focal Charge Compensation. Aufladungseffekte sind deutlich sichtbar. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.

Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM ohne Focal Charge Compensation. Aufladungseffekte sind deutlich sichtbar. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.
Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM mit Focal Charge Compensation. Die Aufladungseffekte sind abgeschwächt. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.
Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM mit Focal Charge Compensation. Die Aufladungseffekte sind abgeschwächt. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.
Axonbündel einer Ratte, abgebildet mit Hochvakuum-SEM mit Focal Charge Compensation. Die Aufladungseffekte sind abgeschwächt. Bild mit freundlicher Genehmigung des National Center for Microscopy and Imaging Research (NCMIR), University of California, San Diego, USA.

Die Animation zeigt einen Durchlauf durch einzelne Schnitte (x–y) des Rückenmarks einer Ratte mit SBF und Focal Charge Compensation. Einzelne Lamellen in den Myelinscheiden der Axone sind deutlich sichtbar, ebenso wie Mikrotubuli und andere Zellorganellen im Originaldatensatz.

Diese SBF-SEM-Aufnahme liefert Informationen in hoher Auflösung, mit denen sich die Anzahl der einzelnen Myelinlamellen zählen und die Gesamtdicke der Myelinscheide messen lässt. Die mit Focal Charge Compensation aufgenommenen Bilder zeigen keine Aufladungseffekte, auch nicht in den großen Bereichen mit reinem Harz.

Identifizierung von Astrozyten in einer Hirnprobe

Diese Probe wurde mit SBF-SEM abgebildet. Astrozyten (türkis) lassen sich schnell und einfach identifizieren, visualisieren und in 3D segmentieren. Mit freundlicher Genehmigung von P. Munro und H. Armer, UCL – Institute of Ophthalmology, London, Vereinigtes Königreich.

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