ZEISS Correlative Cryo Workflow

Spindelpolkörperchen in Hefezellen lassen sich nur schwer lokalisieren. Diese Strukturen sind klein und selten. Mit dem ZEISS Correlative Cryo Workflow können Sie diese Zellstrukturen im naturnahen Zustand erkennen. Das LSM mit dem Airyscan-Detektor vereinfacht die Erkennung dieser Strukturen noch weiter, sodass zusätzliche Details abgebildet werden können. Alle Bilder – von einem ersten Überblick über die gesamte Zelle bis hin zu hochauflösenden Bildern dieser winzigen Strukturen – werden in einem ZEN Connect-Projektordner zusammengeführt, in dem alle erforderlichen Daten zur Relokalisierung dieser Zellstrukturen im FIB-SEM gespeichert werden.

Mit Crossbeam können TEM-Lamellen der identifizierten Bereiche präpariert werden, zur weiteren Untersuchung mit der Kryo-Elektronentomographie. Auch die volumetrische Bildgebung ist möglich. Die Workflow-Lösung bietet zudem eine Funktion, mit der Sie nach der Bildaufnahme alle Daten wieder miteinander in Verbindung bringen können. Die Crossbeam-Bilder oder die TEM-Tomogramme lassen sich mit den LSM-Daten zusammenführen und im dreidimensionalen Kontext rendern.

_{Mit NUP-(Kernporenkomplex-)GFP und CNM67-tdTomato markierte Hefezellen.
Probe und Tomogramm mit freundlicher Genehmigung von M. Pilhofer, ETH Zürich, Schweiz}

Krebszellen zeigen einen starken Phänotyp gegen die mitochondriale Teilung, der potenziell ihre Arzneimittelresistenz erklärt. Chemische Fixationsmethoden erzeugen häufig Artefakte, beispielsweise eine Ablagerung von Mitochondrien, die als Teilungsereignisse fehlinterpretiert werden können. Die Kryofixation umgeht diese Artefakte und konserviert die Proben im naturnahen Zustand.

Das Beispiel zeigt Adenokarzinomzellen nach dem Tauchgefrieren auf Saphirscheiben. Die LSM-Daten zeigen bereits ein dichtes mitochondriales Netz mit erhöhter Teilung, das nachfolgend durch die Crossbeam-Daten bestätigt wird. Nach der Aufnahme mit LSM und Airyscan wurde die vitrifizierte Probe zu Crossbeam transferiert. ZEN Connect konnte die relevanten Bereiche relokalisieren, wodurch der entsprechende Datensatz nach der Aufnahme überlagert und alle erfassten Bilder geordnet wurden.

Ganze Würmer der Art C. elegans wurden mit HPF fixiert und embryonale Zellen in der Metaphase wurden in situ mit der Kryofluoreszenzmikroskopie abgebildet. Anschließend wurden die untersuchten Würmer per Gefrieraustausch mit Schwermetallen markiert, in Harz eingebettet und geschnitten, sodass dasselbe Volumen mit hoher Auflösung und hohem Kontrast durch Crossbeam lokalisiert und dargestellt werden konnte. Mit diesem Workflow konnte die gewünschte Metaphase erfolgreich rekonstruiert werden. Dieser Ansatz führte zudem zu einigen Zufallsentdeckungen: Ein nahegelegenes interessantes punktförmiges Fluoreszenzsignal konnte mit einem mutmaßlichen Autophagosom korreliert werden.

Die Kryofluoreszenzmikroskopie von hochdruckgefrorenen dicken Proben kann somit transiente Zellstrukturen im naturnahen Zustand festhalten und abbilden. Durch die sachgemäße Verarbeitung und die anschließende korrelative volumetrische EM-Bildgebung können diese Zielarchitekturen dann in hoher Auflösung und in 3D rekonstruiert werden.

_{Mit freundlicher Genehmigung von Kedar Narayan, National Cancer Institute / NIH und Frederick National Laboratory for Cancer Research, USA}