EM de volumen con FIB-SEM criogénica
Técnicas de EM de volumen

FIB-SEM criogénica

Capte una instantánea de la dinámica celular en estados casi naturales en ultrarresolución

  • Preservación casi natural y sin artefactos de muestras biológicas
  • Máxima resolución en el eje z
  • Captura de imágenes isotrópicas en 3D

EM de volumen con FIB-SEM criogénica

Con la FIB-SEM, se capturan imágenes de la muestra con el SEM y, a continuación, un haz de iones focalizado fresa hasta 3-10 nm antes de volver a tomar imágenes secuencialmente. El diminuto tamaño del paso en Z puede calibrarse con la resolución XY del SEM para la captura de imágenes en 3D isotrópicas, lo que convierte a la FIB-SEM en una opción excelente para mediciones en 3D precisas. La fijación química tradicional de células o tejidos para microscopía electrónica puede ocasionar cambios ultraestructurales. La fijación criogénica preservará la muestra en estados casi naturales y la FIB-SEM criogénica, que mantiene la muestra a baja temperatura, captará una instantánea en 3D en estado casi natural en ultrarresolución de los acontecimientos celulares. Puede combinarse con otros métodos criogénicos, como la microscopía óptica y confocal.

Representación esquemática de un flujo de trabajo típico

Fresado de FIB-SEM criogénica

1

Con un FIB, se fresa un borde en una muestra vitrificada y sin tinción hasta que la estructura en cuestión se hace visible.

Adquisición de imágenes de FIB-SEM criogénica

2

Se capturan imágenes de la superficie de la muestra recién expuesta de la estructura de interés. Este proceso de fresado y captura de imágenes se repite hasta que se ha capturado una imagen completa de la estructura. La muestra permanece vitrificada durante todo el proceso.

Segmentación de procesamiento

3

Las imágenes de microscopio electrónico adquiridas se procesan y alinean digitalmente en un conjunto de datos en 3D. Los compartimentos celulares se pueden identificar y segmentar.

Análisis de visualización en 3D

4

El conjunto segmentado de datos en 3D se puede visualizar, investigar y analizar estadísticamente.

Ejemplo de aplicación

Comprender el proceso de biomineralización de cristales de calcita en un cocolitóforo

S. Sviben y A. Scheffel, Instituto Max Planck de Fisiología Molecular de Plantas, y L. Bertinetti, Instituto Max Planck de Coloides e Interfaces, Potsdam-Golm, Alemania

Formación de cocolitos en el cocolitóforo Emiliania Huxleyi

Visualización de partículas de calcita y su entorno ultraestructural

Es difícil capturar imágenes del entorno ultraestructural de las fases cálcicas solubles y amorfas de los cocolitóforos con los protocolos clásicos de preparación de base acuosa. Bajo condiciones criogénicas, el FIB-SEM permite captar imágenes de algas marinas vitrificadas en estado casi natural, dilucidando la ultraestructura en 3D.

Las células de E. huxleyi se congelaron bajo alta presión. Durante el proceso de captura de imágenes, la muestra se mantuvo en estado de congelación; el conjunto de datos FIB-SEM se adquirió utilizando un ZEISS Crossbeam en condiciones criogénicas. La reconstrucción en 3D muestra los cocolitos maduros (amarillo), un cocolito in statu nascendi (azul) y cuerpos lipídicos (rojo).

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