Aplicaciones de FIB-SEM criogénica
Courtesy of R. Niessner, N. Ivleva, M. Seidel, A. Kunze, Institute of Hydrochemistry, Chair for Analytical Chemistry, TU Muenchen, Germany.
Resumen

Aplicaciones de FIB-SEM criogénica

Descubra ejemplos innovadores

Con la FIB-SEM, se captan imágenes de la muestra con el haz de electrones del SEM, antes de que un haz de iones focalizado frese hasta 3-10 nm. A continuación, se vuelven a captar imágenes de la muestra y se repite el proceso para generar una vista de alta resolución de todo el volumen en 3D. La FIB-SEM criogénica genera estos volúmenes a partir de muestras vitrificadas y permite captar la ultraestructura tridimensional en estado casi natural.

Comprender la función de los acontecimientos de fisión mitocondrial en el cáncer

Las células cancerosas presentan un fuerte fenotipo hacia la fisión mitocondrial, lo que puede explicar potencialmente su resistencia a los fármacos. Comprender cómo y por qué se desarrolla este fenotipo en las células cancerosas y cómo podrían combatirlo los métodos terapéuticos podría ayudar a encontrar métodos para frenar la progresión de la enfermedad.

En este ejemplo de aplicación, la FIB-SEM criogénica se utiliza como parte de un flujo de trabajo completo que conecta la captura de imágenes de fluorescencia con microscopía electrónica criogénica de alta resolución. El enfoque garantiza una evaluación exhaustiva y precisa de los eventos de fisión mitocondrial.

Células de adenocarcinoma congeladas por inmersión

Células de adenocarcinoma congeladas por inmersión

Células de adenocarcinoma congeladas por inmersión

Células de adenocarcinoma congeladas por inmersión

Células de adenocarcinoma congeladas por inmersión

Gracias a la información combinada que puede obtenerse de la captura de imágenes de fluorescencia y ultraestructurales, es posible visualizar la red mitocondrial y confirmar que en esta línea celular de adenocarcinoma existe una mayor incidencia de fisión mitocondrial.

Este conjunto de datos correlativos incluye información fluorescente y estructural de las mismas células, mostrada en contexto mediante ZEN Connect. Las células se cultivaron en discos de zafiro y después se congelaron por inmersión. Los datos de fluorescencia se capturaron con ZEISS LSM 900 con la platina criogénica (el rojo es mCherry-actina y el verde es Mitotracker (mitocondria)) y los datos SEM se capturaron con ZEISS Crossbeam.

Al preparar las muestras con fijación criogénica, se evitan los artefactos que puede provocar la fijación química, como la acumulación de mitocondrias, y la muestra se preserva en un estado casi natural.

Células de adenocarcinoma congeladas por inmersión

Células de adenocarcinoma congeladas por inmersión

Células de adenocarcinoma congeladas por inmersión

Células de adenocarcinoma congeladas por inmersión

Células de adenocarcinoma congeladas por inmersión

Cuando se planifican experimentos que incluyen múltiples plataformas de captura de imágenes, como la FIB-SEM criogénica y la microscopía confocal, la capacidad de pasar fácilmente de una tecnología a otra y encontrar exactamente el mismo lugar para la adquisición de imágenes aumenta considerablemente la eficacia del flujo de trabajo. En este ejemplo, se logró una comprensión más profunda de las células del adenocarcinoma gracias a la perfecta combinación de la información de fluorescencia (mitotracker) del ZEISS LSM 900 y la información estructural mitocondrial del Crossbeam criogénico.

La muestra se conservó criogénicamente y se obtuvieron imágenes de ella a temperaturas criogénicas, tanto en ZEISS LSM 900 como en ZEISS Crossbeam. La facilidad del flujo de trabajo hace que este tipo de enfoque sea asequible incluso para los usuarios menos experimentados en las distintas tecnologías.

Comprender la estructura celular a nivel ultraestructural

El proceso y el alcance de la mielinización de los axones revisten una gran importancia para el funcionamiento eficaz del sistema nervioso. Controlar cómo cambia el grosor de la mielina en una enfermedad o en distintas afecciones puede ayudar a comprender los procesos de mielinización y desmielinización. Esto, a su vez, puede conllevar el desarrollo de enfoques terapéuticos para tratar afecciones en las que se ha interrumpido la mielinización.

La visualización de alta resolución de la estructura de la mielina y el axón es fundamental para evaluar cuantitativamente el grosor de la mielina. Mediante la fijación criogénica, se mantiene el estado natural de la estructura celular y con la adquisición de alto contraste mediante FIB-SEM criogénica es posible medir con precisión el grosor de la mielina en 3D sin necesidad de añadir ningún medio de contraste de metales pesados.

Nervio óptico de ratón congelado bajo alta presión a los 14 días

Nervio óptico de ratón congelado bajo alta presión a los 14 días

Nervio óptico de ratón congelado bajo alta presión a los 14 días

Nervio óptico de ratón congelado bajo alta presión a los 14 días (−150°C). Imagen captada con ZEISS Crossbeam.

Nervio óptico de ratón congelado bajo alta presión a los 14 días (−150°C). Imagen captada con ZEISS Crossbeam.

El FIB-SEM puede generar estas perspectivas volumétricas de alta resolución y alto contraste de muestras crioconservadas sin necesidad de añadir ningún agente de contraste de metales pesados.

El conjunto de datos en 3D del que se tomó esta única imagen en 2D se captó a -150°C para así poder obtener imágenes de la muestra en su estado casi natural. Con ZEISS Crossbeam, se realizaron simultáneamente la captura de imágenes y el fresado de la muestra, lo que aumentó significativamente la eficacia de la adquisición completa.

Se aprecian numerosos axones (ax) mielinizados y el cuerpo celular con núcleo (nu) y orgánulos como las mitocondrias y el aparato de Golgi. También se aprecia el aparato de Golgi (g) dentro del proceso de otra célula, así como el colágeno de la matriz extracelular (em) que forma la piamadre del nervio.

Explorar el proceso de biomineralización de cristales de calcita en un cocolitóforo

Es difícil capturar imágenes del entorno ultraestructural de las fases cálcicas solubles y amorfas de los cocolitóforos con los protocolos clásicos de preparación de base acuosa. Sin embargo, con el FIB-SEM utilizado en condiciones criogénicas, se pueden obtener imágenes de algas marinas vitrificadas en estado casi natural para dilucidar su ultraestructura en 3D.

El ZEISS FIB-SEM le permite la captura de imágenes volumétricas de alto contraste sin tinción con metales pesados. Mediante el detector selectivo de energía de electrones retrodispersados (EsB) del ZEISS Crossbeam, se pueden obtener imágenes en 3D que permiten diferenciar los cocolitos maduros de los cocolitos in statu nascendi. Al mismo tiempo, las imágenes de electrones secundarios in-lens también son capaces de revelar compartimentos unidos a membranas.

El vídeo muestra una visualización en 3D del cocolitóforo Emiliania huxleyi. Las células de E. huxleyi se recogieron por centrifugación, se congelaron bajo alta presión y se conservaron en N2 líquido. Durante todo el proceso de preparación y obtención de datos, la temperatura no superó nunca los -150 °C. La reconstrucción en 3D muestra los cocolitos maduros (en amarillento), un cocolito in statu nascendi (azul) y cuerpos lipídicos (rojo).

La superficie de la muestra se retira con el FIB y, a continuación, se capturan imágenes de la superficie de la muestra recién expuesta con el haz de electrones. Este proceso de fresado y captura de imágenes se repite una y otra vez (resolución de la imagen: 2048 x 1536 nm).

Comprender la estructura y la función de las bacterias, como la E. Coli

La Escherichia coli (E. coli) suele vivir en los intestinos de personas y animales sanos. Normalmente esta bacteria es inocua, aunque algunas cepas pueden causar síntomas médicos como diarrea, dolor de estómago y fiebre baja. Comprender la estructura de E. coli y cómo responde y cambia en presencia de diferentes fármacos puede ayudar a desarrollar nuevos tratamientos y enfoques preventivos.

La microscopía electrónica de bacterias permite llevar a cabo análisis de alta resolución que ayudan a comprender su estructura y función, algo que a menudo resulta difícil de conseguir con la microscopía óptica. Ampliar el análisis estructural a 3D garantiza que se pueda generar una imagen completa de la bacteria, de modo que no se pierda ningún detalle del volumen. Aunque existen diferentes enfoques, muchos de ellos requieren añadir agentes potenciadores del contraste. Aquí es donde la FIB-SEM criogénica es una tecnología fundamental, ya que proporciona la capacidad de captar imágenes de la bacteria en estado casi natural sin necesidad de añadir agentes de contraste.

Escherichia coli

Escherichia coli

Escherichia coli

Escherichia coli. Muestra cortesía de R. Niessner, N. Ivleva, M. Seidel, A. Kunze, Instituto de Química Analítica e Hidroquímica, Universidad Técnica de Múnich, Alemania.

Escherichia coli. Muestra cortesía de R. Niessner, N. Ivleva, M. Seidel, A. Kunze, Instituto de Química Analítica e Hidroquímica, Universidad Técnica de Múnich, Alemania.

En este caso interesaba la morfología natural de esta muestra bacteriana de E. Coli. En la imagen se aprecia la estructura en 3D de la E. coli, así como algunas nanopartículas de plata que recubren el exterior de la bacteria.

Se capturaron imágenes de la muestra con FIB-SEM criogénica utilizando el detector Inlens.

Escherichia coli

Escherichia coli

Escherichia coli

Escherichia coli. Muestra cortesía de R. Niessner, N. Ivleva, M. Seidel, A. Kunze, Instituto de Química Analítica e Hidroquímica, Universidad Técnica de Múnich, Alemania.

Escherichia coli. Muestra cortesía de R. Niessner, N. Ivleva, M. Seidel, A. Kunze, Instituto de Química Analítica e Hidroquímica, Universidad Técnica de Múnich, Alemania.

Las nanopartículas de plata se aprecian especialmente en este conjunto de datos y, cuando esta información se combina con las imágenes tomadas con el detector InLens, se obtiene una gran visión de la estructura en 3D y la superficie de las bacterias. Esta imagen fue tomada con el detector EsB.

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