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Anwendungen für die Kryo-FIB-SEM

Inspirierende Beispiele entdecken

Bei der FIB-SEM wird die Probe mit dem Elektronenstrahl des SEM abgebildet. Anschließend schneidet ein fokussierter Ionenstrahl eine dünne Schicht von 3–10 nm ab. Die Probe wird dann erneut abgebildet und der Vorgang wird wiederholt, bis eine Ansicht des gesamten 3D-Volumens in hoher Auflösung aufgebaut wurde. Die Kryo-FIB-SEM erzeugt diese Volumina aus vitrifizierten Proben und ermöglicht die Aufnahme der 3D-Ultrastruktur in nahezu nativem Zustand.

Die Rolle von mitochondrialen Teilungsereignissen bei Krebs

Krebszellen zeigen einen starken Phänotyp gegen die mitochondriale Teilung, der potenziell ihre Arzneimittelresistenz erklärt. Wenn bekannt ist, wie und warum sich dieser Phänotyp in Krebszellen entwickelt und wie Therapieverfahren einen solchen Phänotyp bekämpfen könnten, lässt sich damit die Suche nach Methoden unterstützen, mit denen die Krankheitsprogression abgeschwächt werden kann.

In diesem Anwendungsbeispiel wird die Kryo-FIB-SEM im Rahmen eines Workflows eingesetzt, der Fluoreszenzbildgebung und hochaufgelöste Kryo-Elektronenmikroskopie verbindet. Dadurch lassen sich mitochondriale Teilungsereignisse umfassend und präzise beurteilen.

Anhand der kombinierten Daten aus der Fluoreszenzbildgebung und dem ultrastrukturellen Imaging lässt sich das mitochondriale Netz visualisieren und daraus ablesen, dass diese Adenokarzinomzelllinie eine erhöhte Inzidenz mitochondrialer Teilung zeigt.

Dieser korrelative Datensatz enthält sowohl Fluoreszenz- als auch Strukturdaten aus denselben Zellen, die mit ZEN Connect im Kontext dargestellt werden. Die Zellen wurden auf Saphirscheiben gezüchtet und dann tauchgefroren. Die Fluoreszenzdaten wurden mit ZEISS LSM 900 mit Kühltisch erfasst (rot: actin-mCherry, grün: Mitotracker [Mitochondrien]), die SEM-Daten mit ZEISS Crossbeam.

Die Probenpräparation mit Kryofixierung umgeht Artefakte, die infolge einer chemischen Fixierung entstehen können (z. B. Ansammlungen von Mitochondrien), und bewahrt die Probe im nahezu nativen Zustand.

Bei der Planung von Versuchen mit mehreren Imaging-Plattformen (z. B. Kryo-FIB-SEM und Konfokalmikroskopie) ist es möglich, mühelos zwischen den Technologien zu wechseln und genau die richtige Position für die Bildaufnahme zu ermitteln. Das steigert die Workflow-Effizienz erheblich. In diesem Beispiel konnten tiefere Einblicke in die Adenokarzinomzellen erzielt werden, weil Fluoreszenzdaten (Mitotracker) von ZEISS LSM 900 und Daten zur mitochondrialen Struktur aus der Kryo-Untersuchung mit Crossbeam nahtlos zusammengeführt wurden.

Die Probe wurde kryokonserviert und bei Tieftemperaturen sowohl mit ZEISS LSM 900 als auch mit ZEISS Crossbeam abgebildet. Der einfache Workflow eignet sich selbst für Nutzer, die mit den verschiedenen Technologien weniger erfahren sind.

Zellstruktur auf ultrastruktureller Ebene

Der Prozess und das Ausmaß der Axon-Myelinisierung ist für die effiziente Funktion des Nervensystems von großer Bedeutung. Werden Veränderungen der Myelindicke bei einer Erkrankung oder unter anderen Bedingungen überwacht, kann dies dazu beitragen, die Abläufe bei der Myelinisierung und Demyelinisierung besser nachzuvollziehen. Dadurch wird es wiederum möglich, therapeutische Ansätze für die Behandlung von Erkrankungen zu entwickeln, bei denen die Myelinisierung gestört ist.

Bei der quantitativen Beurteilung der Myelindicke kommt es darauf an, die Myelin- und Axonstruktur in hoher Auflösung zu visualisieren. Die Kryofixierung bewahrt den nativen Zustand der Zellstruktur, und die kontrastreiche Erfassung mit der Kryo-FIB-SEM ermöglicht die präzise Messung der Myelindicke in 3D, ganz ohne schwermetallhaltige Kontrastmittel.

Hochdruckgefrorener Sehnerv einer Maus nach 14 Tagen (–150 °C). Bild aufgenommen mit ZEISS Crossbeam.

Die FIB-SEM liefert hochaufgelöste, kontrastreiche volumetrische Erkenntnisse zu kryokonservierten Proben ganz ohne schwermetallhaltige Kontrastmittel.

Der 3D-Datensatz, aus dem dieses einzelne 2D-Bild stammt, wurde bei −150 °C aufgenommen. Die Probe konnte also im nahezu nativen Zustand verbleiben. Mit ZEISS Crossbeam wurde die Probe gleichzeitig abgebildet und geschnitten, wodurch der gesamte Aufnahmevorgang erheblich effizienter ablief.

Zahlreiche myelinisierte Axone (ax), der Zellkörper mit Zellkern (nu) und Organellen wie Mitochondrien und Golgi-Apparat sind sichtbar. Auch der Golgi-Apparat (g) im Prozess einer anderen Zelle ist erkennbar, ebenso wie das Collagen der extrazellulären Matrix (em), die die Pia des Nervs bildet.

Untersuchung der Biomineralisierung von Calcit-Kristallen in einer Coccolithophorida

Die Ultrastrukturumgebung der löslichen amorphen Calciumphasen von Coccolithophoriden lässt sich mit den klassischen wasserbasierten Präparationsprotokollen nur schwer abbilden. Mit FIB-SEM unter Kryobedingungen können vitrifizierte Meeresalgen jedoch im nahezu nativen Zustand abgebildet werden, sodass ihre Ultrastruktur in 3D wiedergegeben wird.

Das ZEISS FIB-SEM erlaubt die kontrastreiche volumetrische Bildgebung ohne zusätzliche Kontrastierung mit Schwermetallen. Mit dem energieselektiven Rückstreuelektronendetektor (Energy selective Backscattered Detector, EsB-Detektor) von ZEISS Crossbeam lassen sich 3D-Bilder aufnehmen, die die Differenzierung reifer Coccolithen und Coccolithen in statu nascendi ermöglichen. Gleichzeitig legen die Inlens-Sekundärelektronenbilder die membrangebundenen Kompartimente offen.

Das Video zeigt eine 3D-Visualisierung von Coccolithophorida Emiliania huxleyi. Zellen von E. huxleyi wurden durch Zentrifugation gewonnen, hochdruckgefroren und in Flüssigstickstoff eingelegt. Im gesamten Präparations- und Datenerfassungsprozess war die Temperatur nie höher als –150 °C. Die 3D-Rekonstruktion zeigt die reifen Coccolithen (gelblich), einen Coccolithen in statu nascendi (blau) sowie die Lipidkörper (rot).

Die Probenoberfläche wird mit dem fokussierten Ionenstrahl abgetragen. Anschließend wird die soeben freigelegte Probenoberfläche mit dem Elektronenstrahl abgebildet. Dieser Schnitt- und Bildgebungsvorgang wird fortlaufend wiederholt (Bildauflösung: 2048 × 1536 nm).

Struktur und Funktion von Bakterien wie E. coli

Escherichia coli (E. coli) kommt normalerweise im Darm gesunder Menschen und Tiere vor. In der Regel ist dieses Bakterium harmlos. Bestimmte Stämme können jedoch medizinische Symptome wie Durchfall, Magenschmerzen und leichtes Fieber auslösen. Wenn bekannt ist, wie die Struktur von E. coli aufgebaut ist und sie sich in Reaktion auf verschiedene medizinische Wirkstoffe verändert, kann dies die Entwicklung neuer Medikamente und Vorbeugemaßnahmen unterstützen.

Die Elektronenmikroskopie von Bakterien ermöglicht eine Analyse in hoher Auflösung, die dazu beiträgt, Struktur und Funktion dieser Bakterien nachzuvollziehen. Mit der optischen Mikroskopie ist dies dagegen oft nur schwer umsetzbar. Eine auf 3D erweiterte Strukturanalyse liefert ein vollständiges Bild des Bakteriums, sodass keine Details im Volumen übersehen werden. Es stehen verschiedene Verfahren zur Auswahl, die jedoch größtenteils mit Kontrastmitteln arbeiten. Hier spielt die Kryo-FIB-SEM ihre Stärken aus, denn damit lässt sich das Bakterium im nahezu nativen Zustand ganz ohne Kontrastmittel abbilden.

Die native Morphologie dieser E.-coli-Bakterienprobe war hier von Interesse. Das Bild zeigt die 3D-Struktur des E.-coli-Bakteriums sowie einige Silber-Nanopartikel an der Außenseite des Bakteriums.

Die Probe wurde mit Kryo-FIB-SEM und dem Inlens-Detektor abgebildet.

Die Silber-Nanopartikel sind in diesem Datensatz besonders gut sichtbar. Im Kombination mit den Bildern des Inlens-Detektors liefern diese Daten umfassende Erkenntnisse zu 3D-Struktur und Oberfläche des Bakteriums. Dieses Bild wurde mit dem EsB-Detektor aufgenommen.

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