Applications pour FIB-SEM Cryo
Courtesy of R. Niessner, N. Ivleva, M. Seidel, A. Kunze, Institute of Hydrochemistry, Chair for Analytical Chemistry, TU Muenchen, Germany.
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Applications pour FIB-SEM Cryo

Découvrez des exemples inspirants

Avec le FIB-SEM, les échantillons sont imagés avec le faisceau d'électrons du MEB avant qu'un faisceau d'ions focalisé ne broie des particules de 3 à 10 nm. L'échantillon est ensuite à nouveau imagé et le processus est répété pour obtenir une vue à haute résolution du volume 3D complet. Le FIB-SEM cryogénique génère ces volumes à partir d'échantillons vitrifiés et permet de capturer l'ultrastructure 3D à l'état proche du natif.

Comprendre le rôle des événements de fission mitochondriale dans le cancer

Les cellules cancéreuses présentent un fort phénotype de fission mitochondriale qui peut expliquer potentiellement leur résistance aux médicaments. Comprendre comment et pourquoi ce phénotype se développe dans les cellules cancéreuses et comment les méthodes thérapeutiques peuvent combattre ce phénotype pourrait contribuer à la recherche de méthodes permettant d'atténuer l'évolution de la maladie.

Dans cet exemple d'application, le FIB-SEM Cryo est utilisé dans le cadre d'un flux de tâches complet qui associe l'imagerie par fluorescence à la cryo-microscopie électronique à haute résolution. Cette approche permet une évaluation complète et précise des événements de fission mitochondriale.

Cellules d'adénocarcinome congelées en plongée

Cellules d'adénocarcinome congelées en plongée

Cellules d'adénocarcinome congelées en plongée

Cellules d'adénocarcinome congelées en plongée

Cellules d'adénocarcinome congelées en plongée

En combinant les informations fournies par l'imagerie de fluorescence et l'imagerie ultrastructurelle, il est possible de visualiser le réseau mitochondrial et de confirmer que cette lignée cellulaire d'adénocarcinome présente une incidence accrue de fission mitochondriale.

Cet ensemble de données corrélatives comprend des informations fluorescentes et structurelles provenant des mêmes cellules, affichées en contexte à l'aide de ZEN Connect. Les cellules ont été cultivées sur des disques de saphir, puis congelées. Les données de fluorescence ont été capturées à l'aide du ZEISS LSM 900 avec l'étage cryogénique (le rouge est l'actine-mCherry et le vert est le Mitotracker (mitochondries)) et les données MEB ont été capturées à l'aide du ZEISS Crossbeam.

La préparation des échantillons par cryofixation permet d'éviter les artefacts pouvant être causés par la fixation chimique, tels que l'accumulation de mitochondries, et de préserver l'échantillon dans un état proche de l'état natif.

Cellules d'adénocarcinome congelées en plongée

Cellules d'adénocarcinome congelées en plongée

Cellules d'adénocarcinome congelées en plongée

Cellules d'adénocarcinome congelées en plongée

Cellules d'adénocarcinome congelées en plongée

Lors de la planification d'expériences impliquant plusieurs plateformes d'imagerie telles que FIB-SEM Cryo et la microscopie confocale, la possibilité de passer facilement d'une technologie à l'autre et de trouver exactement le même endroit pour l'acquisition d'images augmente considérablement l'efficacité du flux de tâches. Dans cet exemple, une compréhension plus approfondie des cellules de l'adénocaricome a pu être obtenue grâce à la combinaison transparente des informations de fluorescence (Mitotracker) du ZEISS LSM 900 et des informations structurelles mitochondriales du Crossbeam cryogénique.

L'échantillon a été préservé par cryogénie et imagé à des températures cryogéniques, à la fois sur ZEISS LSM 900 et sur ZEISS Crossbeam. La facilité de réalisation du flux de tâches rend ce type d'approche possible, même pour un utilisateur moins expérimenté avec les différentes technologies.

Comprendre la structure cellulaire au niveau ultrastructurel

Le processus et l'étendue de la myélinisation des axones sont primordiales pour le bon fonctionnement du système nerveux. En cas de maladie ou dans différentes conditions, le suivi des modifications de l'épaisseur de la myéline peut aider à comprendre les processus de myélinisation et de démyélinisation, lesquels peuvent conduire au développement d'approches thérapeutiques pour traiter les conditions dans lesquelles la myélinisation a été perturbée.

La visualisation à haute résolution de la structure de la myéline et de l'axone est essentielle pour l'évaluation quantitative de l'épaisseur de la myéline. La fixation cryogénique permet de conserver l'état natif de la structure cellulaire et, grâce à l'acquisition à contraste élevé par FIB-SEM cryogénique, il est possible de mesurer précisément l'épaisseur de la myéline en 3D sans devoir ajouter d'agents de contraste à base de métaux lourds.

Nerf optique de souris congelé à haute pression à 14 jours

Nerf optique de souris congelé à haute pression à 14 jours

Nerf optique de souris congelé à haute pression à 14 jours

Nerf optique de souris congelé à haute pression à 14 jours (−150 °C). Image capturée avec ZEISS Crossbeam.

Nerf optique de souris congelé à haute pression à 14 jours (−150 °C). Image capturée avec ZEISS Crossbeam.

Le FIB-SEM peut générer ces images volumétriques à haute résolution et à contraste élevé de spécimens cryoconservés sans qu'il soit nécessaire d'ajouter des agents de contraste à base de métaux lourds.

L'ensemble de données 3D à partir duquel cette seule image 2D a été prise a été capturé à -150 °C afin que l'échantillon puisse être imagé dans son état proche de l'état natif. Grâce au ZEISS Crossbeam, l'imagerie et le broyage de l'échantillon ont été réalisés simultanément, ce qui a permis d'améliorer considérablement l'efficacité de l'acquisition complète.

De nombreux axones myélinisés (ax), le corps cellulaire avec le noyau (nu) et les organites comme les mitochondries et le complexe de Golgi sont visibles. Le complexe de golgi (g) dans le processus d'une autre cellule est également discernable ainsi que le collagène de la matrice extracellulaire (em) formant la pie-mère du nerf.

Explorer le processus de biominéralisation des cristaux de calcite dans une algue coccolithophoridée

L'environnement ultrastructurel des phases calciques solubles et amorphes des coccolithophores est difficile à imager avec les protocoles de préparation classiques à base d'eau. Cependant, utiliser le FIB-SEM dans des conditions de cryogénisation permet d'imager les algues marines vitrifiées à l'état proche de l'état natif pour élucider leur ultrastructure en 3D.

Le ZEISS FIB-SEM permet une imagerie volumétrique à fort contraste sans coloration de métaux lourds. Grâce au détecteur d'électrons rétrodiffusés sélectifs en énergie (EsB) du ZEISS Crossbeam, il est possible d'acquérir des images en 3D qui permettent de différencier les coccolithes matures des coccolithes in statu nascendi. En même temps, les images d'électrons secondaires dans l'objectif sont également capables de révéler des compartiments liés à la membrane.

La vidéo montre une visualisation 3D du coccolithophore Emiliania huxleyi. Les cellules d'E. huxleyi ont été collectées par centrifugation, congelées à haute pression et stockées dans du N2 liquide. Tout au long du processus de préparation et d'acquisition des données, la température n'a jamais dépassé les -150 °C. La reconstruction 3D montre les coccolithes matures (en jaunâtre), un coccolithe en statu nascendi (bleu) et les corps lipidiques (rouge).

La surface de l'échantillon est enlevée à l'aide du faisceau d'ions focalisés, puis la surface de l'échantillon fraîchement exposée est imagée à l'aide du faisceau d'électrons. Ce processus de broyage et d'imagerie est répété à plusieurs reprises (résolution de l'image : 2048 x 1536 nm).

Comprendre la structure et la fonction des bactéries telles que E. Coli

Les bactéries Escherichia coli (E. coli) vivent normalement dans les intestins des personnes et des animaux en bonne santé. En général, cette bactérie est inoffensive, mais certaines souches peuvent provoquer des symptômes médicaux tels que des diarrhées, des douleurs d'estomac et des fièvres légères. La compréhension de la structure d'E. coli et de la manière dont cette structure réagit et change en présence de différents agents médicaux peut contribuer au développement de nouveaux traitements et d'approches préventives.

La microscopie électronique des bactéries permet une analyse à haute résolution qui aide à comprendre leur structure et leur fonction. Il est souvent difficile d'y parvenir en utilisant la microscopie optique. L'extension de l'analyse structurelle à la 3D permet d'obtenir une image complète de la bactérie, de sorte qu'aucun détail du volume n'est oublié. Différentes approches sont disponibles, mais beaucoup d'entre elles nécessitent l'ajout d'agents de contraste. C'est là que le FIB-SEM cryogénique est une technologie vitale. En effet, il permet d'obtenir des images de la bactérie dans son état proche de l'état natif, sans ajout d'agents de contraste.

Escherichia coli

Escherichia coli

Escherichia coli

Escherichia coli. Échantillon fourni avec l'aimable autorisation de R. Niessner, N. Ivleva, M. Seidel, A. Kunze, Institut d'hydrochimie, Chaire de chimie analytique, Université technique de Munich, Allemagne.

Escherichia coli. Échantillon fourni avec l'aimable autorisation de R. Niessner, N. Ivleva, M. Seidel, A. Kunze, Institut d'hydrochimie, Chaire de chimie analytique, Université technique de Munich, Allemagne.

La morphologie native de cet échantillon bactérien d'E. coli s'est révélée intéressante ici. La structure 3D de l'E. coli est visible sur l'image, ainsi que des nanoparticules d'argent qui recouvrent l'extérieur de la bactérie.

L'échantillon a été imagé par FIB-SEM cryogénique à l'aide du détecteur Inlens.

Escherichia coli

Escherichia coli

Escherichia coli

Escherichia coli. Échantillon fourni avec l'aimable autorisation de R. Niessner, N. Ivleva, M. Seidel, A. Kunze, Institut d'hydrochimie, Chaire de chimie analytique, Université technique de Munich, Allemagne.

Escherichia coli. Échantillon fourni avec l'aimable autorisation de R. Niessner, N. Ivleva, M. Seidel, A. Kunze, Institut d'hydrochimie, Chaire de chimie analytique, Université technique de Munich, Allemagne.

Les nanoparticules d'argent sont particulièrement visibles dans cet ensemble de données et lorsque cette information est combinée avec les images prises avec le détecteur InLens, elle fournit un grand nombre d'informations sur la structure 3D et la surface de la bactérie. Cette image a été prise avec le détecteur EsB.

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