Volumen-EM mit Kryo-FIB-SEM​
Volumen-EM-Verfahren

Kryo-FIB-SEM​

Ultraaufgelöste Momentaufnahme der Zelldynamik in nahezu nativen Zuständen​

  • Nahezu native, artefaktfreie Bewahrung biologischer Proben
  • Höchste Z-Auflösung​
  • Isotropes 3D-Imaging

Volumen-EM mit Kryo-FIB-SEM

Bei der FIB-SEM werden Proben mit dem SEM abgebildet. Anschließend schneidet ein fokussierter Ionenstrahl eine Dünnschicht von 3–10 nm ab, bevor die Probe sequenziell erneut abgebildet wird. Die sehr kleine Schrittweite in Z-Richtung kann anhand der XY-Auflösung des SEM für isotropes 3D-Imaging kalibriert werden. Damit eignet sich die FIB-SEM ideal für präzise 3D-Messungen. Die herkömmliche chemische Fixierung von Zellen oder Gewebe für die Elektronenmikroskopie kann die Ultrastruktur verändern. Die Kryofixierung bewahrt die Probe im nahezu nativen Zustand. Mit der Kryo-FIB-SEM, bei der die niedrige Temperatur der Probe beibehalten wird, wird eine nahezu native 3D-Momentaufnahme der zellulären Ereignisse in ultrahoher Auflösung aufgenommen. Auch die Kombination mit anderen Kryomethoden ist möglich, z. B. Licht- und Konfokalmikroskopie.

Schematische Darstellung eines typischen Workflows​

Kryo-FIB-SEM – Schneiden

1

In eine ungefärbte vitrifizierte Probe wird mit einem fokussierten Ionenstrahl ein Graben geschnitten, bis die relevante Struktur sichtbar wird.

Kryo-FIB-SEM – Bildaufnahme

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Die soeben freigelegte Probenoberfläche der relevanten Struktur wird abgebildet. Dieser Schnitt- und Bildgebungsvorgang wird so lange wiederholt, bis die gesamte relevante Struktur abgebildet wurde. Die Probe bleibt während des gesamten Prozesses vitrifiziert.

Verarbeitung der Segmentierung

3

Die aufgenommenen EM-Bilder werden verarbeitet und digital zu einem 3D-Datensatz zusammengeführt. Die Zellkompartimente lassen sich identifizieren und segmentieren.

3D‑Visualisierungsanalyse

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Der segmentierte 3D-Datensatz kann visualisiert, untersucht und statistisch analysiert werden.

Anwendungsbeispiel

Biomineralisierung von Calcit-Kristallen in einer Coccolithophorida

S. Sviben und A. Scheffel, Max-Planck-Institut für Pflanzenphysiologie, und L. Bertinetti, Max-Planck-Institut für Kolloid- und Grenzflächenforschung, Potsdam-Golm, Deutschland

Bildung von Coccolithen in Coccolithophorida Emiliania huxleyi

Visualisierung von Calcit-Partikeln und ihrer Ultrastrukturumgebung

Die Ultrastrukturumgebung der löslichen amorphen Calciumphasen von Coccolithophoriden lässt sich mit den klassischen wasserbasierten Präparationsprotokollen nur schwer abbilden. Das FIB-SEM unter Kryobedingungen ermöglicht das Imaging vitrifizierter Meeresalgen im nahezu nativen Zustand, wodurch die Ultrastruktur in 3D erkennbar wird.

Zellen von E. huxleyi wurden hochdruckgefroren. Die Probe blieb während der Bildgebung weiter gefroren. Der FIB-SEM-Datensatz wurde mit ZEISS Crossbeam unter Kryobedingungen erfasst. Die 3D-Rekonstruktion zeigt die reifen Coccolithen (gelb), einen Coccolithen in statu nascendi (blau) sowie die Lipidkörper (rot).

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