Volumen-EM-Verfahren

Rasterelektronen-Mikroskopie mit fokussiertem Ionenstrahl

Hochaufgelöste isotrope Volumendaten für präzise 3D‑Rekonstruktionen

Höchste Z-Auflösung
Isotrope 3D‑Messungen
Rekonstruktion subzellulärer Merkmale in korrekten 3D‑Proportionen

Volumen-EM mit SEM mit fokussiertem Ionenstrahl (FIB-SEM)

Bei der FIB-SEM wird die in Harz eingebettete Probe mit dem SEM abgebildet. Anschließend schneidet ein fokussierter Ionenstrahl eine dünne Schicht von 3–10 nm ab, bevor sie sequenziell erneut abgebildet wird. Die sehr kleine Schrittweite in Z-Richtung kann anhand der XY-Auflösung des SEM für isotropes 3D‑Imaging kalibriert werden. Damit eignet sich die FIB-SEM ideal für präzise 3D‑Messungen der Ultrastruktur z. B. von subzellulären Merkmalen oder neuronalen Verbindungen.

Schematische Darstellung eines typischen Workflows

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In eine in Harz eingebettete Probe wird mit einem fokussierten Ionenstrahl ein Graben geschnitten, bis die relevante Struktur sichtbar wird.

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Die soeben freigelegte Probenoberfläche der relevanten Struktur wird abgebildet. Dieser Schnitt- und Bildgebungsvorgang wird so lange wiederholt, bis die gesamte relevante Struktur abgebildet wurde.

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Die aufgenommenen EM-Bilder werden verarbeitet und digital zu einem 3D‑Datensatz zusammengeführt. Die Zellkompartimente lassen sich identifizieren und segmentieren.

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Der segmentierte 3D‑Datensatz kann visualisiert, untersucht und statistisch analysiert werden.

Anwendungsbeispiele

Hochaufgelöste isotrope Visualisierung der zellulären Ultrastruktur in 3D

Datensätze mit freundlicher Genehmigung von Anna Steyer und Yannick Schwab, EMBL Heidelberg, Deutschland

3D‑Imaging von HeLa-Zellen

Automatisiertes 3D‑Serien-Imaging mit der FIB-SEM-Technologie von ZEISS

Mit dem fokussierten Ionenstrahl wurden sequenziell 8 nm dicke Schnitte der Probe abgetragen, während das freigelegte Blockface mit einem SEM gescannt wurde. So entstand ein hochaufgelöstes 3D‑Volumenbild. Die automatisierte Segmentierung und Visualisierung der Zellkomponenten wurde mit einem – in arivis Cloud trainierten – Deep-Learning-Modell in arivis Pro durchgeführt, sodass die verschiedenen Zellkomponenten visualisiert und quantifiziert werden konnten.

3D‑Rekonstruktion des Golgi-Körpers einer Alge auf der Grundlage von Rohdaten nach dem FIB-Schneiden — Bild mit freundlicher Genehmigung von Dr. Louise Hughes, Oxford Brookes University, Vereinigtes Königreich

Charakterisierung des Golgi-Apparats

Erkenntnisse zur Bedeutung für Proteinmodifikation und -transport

Dieses Bild zeigt die 3D‑Rekonstruktion des Golgi-Körpers einer Alge aus einem FIB-SEM-Datensatz. Der Datensatz unterscheidet zwischen der cis- und der trans-Seite des Golgi-Netzwerks (gelb/rot: cis-Golgi, violett/blau: trans-Golgi). Durch die Segmentierung der Zellkomponenten aus den hochaufgelösten Datensätzen, die mit der ZEISS Crossbeam FIB-SEM-Technologie aufgenommen wurden, lassen sich die internen Komponenten präzise charakterisieren und quantifizieren.

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