ZEISS Correlative Cryo Workflow

Los cuerpos polares del huso son difíciles de encontrar en las células de levaduras. Son pequeños y son estructuras que aparecen con poca frecuencia. ZEISS Correlative Cryo Workflow le permite identificar de forma precisa y captar imágenes de dichas estructuras celulares en un estado prácticamente original. El LSM con el detector Airyscan facilita aún más la identificación de estas estructuras para poder captar más detalles en las imágenes. Todas las imágenes, desde la vista general grande de toda la célula hasta las imágenes de alta resolución de estas diminutas estructuras, están organizadas en un proyecto de ZEN Connect que proporciona todos los datos necesarios para volver a ubicar estas estructuras celulares en el FIB-SEM.

Usando Crossbeam, se puede preparar la laminilla de TEM de las regiones especificadas para la tomografía electrónica criogénica. También es posible captar imágenes de volumen. Además, la solución del flujo de trabajo le permite reconectar todos los datos tras la adquisición de las imágenes. Se pueden combinar las imágenes de Crossbeam o los tomogramas del TEM con los datos del LSM y se pueden renderizar en el contexto tridimensional.

_{Células de levadura teñidas con GFP del NUP (complejo de poro nuclear) y CNM67-tdTomato.
Muestra y tomografía cortesía de M. Pilhofer, ETH Zürich, Suiza}

Las células cancerosas presentan un fuerte fenotipo hacia la fisión mitocondrial, lo que explica potencialmente su resistencia a los fármacos. Los métodos de fijación química a menudo crean artefactos como la acumulación de mitocondrias, lo cual se podría malinterpretar como eventos de fisión. La criofijación evita estos artefactos y conserva las muestras en el estado prácticamente original.

El ejemplo muestra células de adenocarcinoma congeladas por inmersión sobre discos de zafiro. Los datos de LSM ya enfatizan una densa red mitocondrial con mayor fisión confirmada a continuación por los datos de Crossbeam. Tras captar las imágenes con LSM y Airyscan, la muestra vitrificada se transfirió a Crossbeam. Se usó ZEN Connect para reubicar las regiones de interés, para solapar el conjunto de datos respectivo tras la adquisición y para organizar todas las imágenes adquiridas.

Se fijaron gusanos C. elegans enteros mediante HPF y se captaron imágenes de células embrionarias en metafase in situ mediante microscopía de fluorescencia criogénica. Después, los gusanos cribados se tiñeron con metales pesados mediante congelación por sustitución, se embutieron en resina y se seccionaron para que se pudiera ubicar y captar el mismo volumen a alta resolución, con un elevado contraste, mediante Crossbeam. Usando este flujo de trabajo, se pudo reconstruir correctamente la metafase objetivo. Además, este enfoque permitió unos descubrimientos fortuitos: se pudo correlacionar una intrigante señal de fluorescencia punteada adyacente con un presunto autofagosoma.

De este modo, la microscopía de fluorescencia criogénica de muestras gruesas congeladas a alta presión se puede usar para atrapar y captar estructuras celulares transitorias en un estado casi original; el procesamiento adecuado y la subsiguiente captura de imágenes EM correlativas del volumen permite la reconstrucción de estas arquitecturas objetivo con elevada resolución y en 3D.

_{Cortesía de Kedar Narayan, Instituto Nacional del Cáncer / NIH y Laboratorio Nacional Frederick para la investigación del cáncer, EE. UU.}