Lattice-Lichtblattmikroskopie für die biowissenschaftliche Forschung

Beim Übergang vom naiven Epiblast in einen pluripotenten Zustand schließen sich mehr als 100 Zellen zu einem Präimplantationsembryo mit einem Durchmesser von rund 60–80 µm zusammen. Zur Untersuchung der Veränderungen bei der Genexpression während dieses Übergangs werden sowohl lebende als auch fixierte Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten mit der Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie abgebildet. Die volumetrische Analyse der zellulären Expressionsmuster erbringt den Nachweis für molekulare Mechanismen, die die Entwicklung muriner Präimplantationsembryonen regulieren.

Um zu ermitteln, welche Zellen bestimmte zelluläre Marker exprimieren und wie diese Zellen relativ zueinander angeordnet sind, ist die volumetrische Bildgebung der Präimplantationsembryonen mittels Konfokalmikroskopie erforderlich. Embryonen in diesem Stadium reagieren empfindlich auf Veränderungen der Wachstumsumgebung, der strukturellen Integrität und der Phototoxizität. Damit sich der Entwicklungsphänotyp nicht anormal veränderte, durften die Embryonen nicht gegen das Deckglas gedrückt werden und mussten bei geringer Phototoxizität rasch abgebildet werden. Als einzige Möglichkeit blieb die Spinning-Disk-Konfokalmikroskopie. Dieses Bildgebungsverfahren brachte eine geringe Phototoxizität mit sich und lieferte nahezu die nötige Geschwindigkeit. Nachteilig war jedoch der drastische Rückgang der Signalintensität mit zunehmender Abbildungstiefe in die Embryonen. Daher wurden die Proben meist nur etwa bis zur halben Tiefe abgebildet.

Das ZEISS Lattice Lightsheet 7 Mikroskop erlaubt bei geringer bis gar keiner Phototoxizität und minimalen Einbußen bei der Signalintensität die Bildgebung der gesamten Tiefe der Embryonen in der erforderlichen Geschwindigkeit (um Bewegungsartefakte zu verhindern). Die volumetrische Bildgebung der Embryonen mit ZEISS Lattice Lightsheet 7 in nahezu isotroper Auflösung lieferte zudem eine präzisere Darstellung der Zellorganisation im Embryo. Mit dieser Bildgebungstechnologie ist es insbesondere möglich, Genexpressionssignaturen in diesem entscheidenden Stadium der embryonalen Entwicklung zu messen.

Abgebildetes Volumen: 230 µm × 124 µm × 94 µm, 30 ms Belichtungszeit, 30 × 1000 Lattice-Lichtblatt, zwei Kanäle.

Die konventionelle Konfokalmikroskopie kann nicht das gesamte 3D-Zellmodell mit einer temporalen Auflösung abbilden, die die Schlagfrequenz übersteigt.

Durch die schnelle volumetrische Bildgebung des ZEISS Lattice Lightsheet 7 in subzellulärer Auflösung ist es möglich, Gewebeabweichungen wie zelluläre Kontraktilität und Lebensfähigkeit zu untersuchen.

Ein Volumen alle 1,26 Sek., 48 Vol./Min. über 1 Min., abgebildetes Volumen: 300 µm × 435 µm × 125 µm, 2 µm Schrittweite, 126 Ebenen pro Volumen, 1 ms Belichtungszeit, 100 × 1800 Lattice-Lichtblatt.

Die Zellen werden auf Cyclo-Olefin-Polymer (COP) mit einer Gitterstruktur gezüchtet, sodass die Bewegung der Wachstumskegel am Gitter entlang beobachtet werden kann. Die Wachstumskegel sind äußerst lichtempfindlich und beginnen zu schrumpfen, wenn sie einem zu starken Anregungslicht ausgesetzt sind. Auch die COP-Gitterstruktur stellt herkömmliche Bildgebungssysteme vor zahlreiche Herausforderungen. Bei der herkömmlichen Laser-Scanning-Konfokalmikroskopie kann es zu Doppelbildartefakten kommen. Zudem liegt der Brechungsindex von COP bei 1,53 (der von Glas dagegen bei 1,52) und die COP-Unterlage ist 200 µm dick. Durch diese Parameter können die Bilder unscharf werden.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 kann diese Herausforderungen bewältigen. Wenn die Gitterstruktur parallel zum Lattice-Lichtblatt ausgerichtet und die spezielle Freiformoptik des Lattice Lightsheet 7 eingestellt wird, lässt sich das Doppelbild entfernen. Das schonende ZEISS Lattice Lightsheet 7 ist zudem das perfekte Werkzeug zur Untersuchung der dynamischen Bewegung sich entwickelnder Neuronen in 4D bei hoher spatiotemporaler Auflösung, ohne die Neuronen mit zu starkem Licht zu stören.

Ein Volumen alle 15 Sek., 21 Volumina in 5 Min., abgebildetes Volumen: 78 µm × 44 µm × 22 µm, 0,3 µm Schrittweite, 134 Ebenen pro Volumen, 20 ms Belichtungszeit, 30 × 1000 Lattice-Lichtblatt, zwei Kanäle.

In früheren Experimenten mit Konfokalmikroskopie beeinträchtigten Photobleaching und Phototoxizität die Datenerfassung.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 ermöglicht die volumetrische Bildgebung der Kugeln, sodass sich die Zellteilungen und Umstrukturierungen nachverfolgen lassen.

Ein Volumen alle 10 Min. über 16 Std., 97 Volumina wurden aufgenommen, abgebildetes Volumen: 520 µm × 540 µm × 32 µm, 12 ms Belichtungszeit, 100 × 1800 Lattice-Lichtblatt.

Die konventionelle Konfokalmikroskopie führt bei diesen Proben zu Phototoxizität.

Mit ZEISS Lattice Lightsheet 7 ist es möglich, Zellen über einen Zeitraum von 12 Stunden in einer ausreichend hohen Auflösung aufzunehmen, bei der Aktin und einzelne Mitochondrien selbst während eines mitotischen Ereignisses erkennbar sind.

Fünf Positionen, ein Volumen alle 10 Minuten über 12 Stunden, 73 Volumina wurden aufgenommen, abgebildetes Volumen: 75 µm × 120 µm × 16 µm pro Position, 30 ms Belichtungszeit, 30 × 1000 Lattice-Lichtblatt, drei Kanäle.

Wenn das gesamte Hirnorganoid in vertretbarer Zeit aufgenommen werden soll, geht die konventionelle Konfokalmikroskopie mit Einbußen einher – entweder bei der Geschwindigkeit oder bei der Auflösung.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 bildet das gesamte Organoid in unter 10 Minuten in einer ausreichend hohen Auflösung ab, bei der einzelne Neuronen voneinander unterschieden werden können.

Abgebildetes Volumen: 1,37 µm × 1,18 µm × 76 µm, 5 ms Belichtungszeit, 100 × 1800 Lattice-Lichtblatt, zwei Kanäle.

Die Weitfeldmikroskopie lieferte zwar die nötige Geschwindigkeit für das Live Imaging von Endothelzellen in Blutgefäßen, doch erst mit ZEISS Lattice Lightsheet 7 ließ sich eine höhere Auflösung insbesondere in axialer Richtung erreichen.

Ein Volumen alle 8 Sek. über 15 Min., 115 Volumina wurden aufgenommen, abgebildetes Volumen: 200 µm × 250 µm × 55 µm, 3 ms Belichtungszeit, 100 × 1800 Lattice-Lichtblatt, zwei Kanäle.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 ermöglicht die volumetrische Bildgebung der ultraschnellen Membrandynamik in nahezu isotroper Auflösung und damit die detaillierte Charakterisierung des Membran-Ruffling.

Ein Volumen alle 1,5 Sek. über 2 Min., 85 Volumina wurden aufgenommen, abgebildetes Volumen: 58 µm × 60 µm × 9 µm, 3 ms Belichtungszeit, 15 × 550 Lattice-Lichtblatt.

Die Bildgebung von Neuronen in einem ganzen C. elegans erfordert das ultraschnelle Imaging großer Volumina – das ist für Technologien wie die konventionelle Konfokalmikroskopie eine echte Herausforderung.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 bietet nicht nur die nötige temporale, sondern auch die richtige räumliche Auflösung, sodass sich einzelne Neuronen im sich bewegenden Wurm identifizieren und verfolgen lassen.

Ein Volumen alle 2 Min. über 1 Std. 20 Min., 41 Volumina wurden aufgenommen, abgebildetes Volumen: 300 µm × 340 µm × 55 µm, 15 ms Belichtungszeit, 100 × 1800 Lattice-Lichtblatt, zwei Kanäle.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 nimmt T-Zellen live in Aktion auf. Die schnelle, schonende volumetrische Bildgebung der zellulären Interaktionen in nahezu isotroper Auflösung macht dieses Gerät zum perfekten Werkzeug für die Untersuchung des Verhaltens und der Funktion von T-Zellen.

Drei Positionen, ein Volumen alle 3 Min. über 2 Std. 15 Min., 507 Ebenen pro Volumen, abgebildetes Volumen: 300 µm × 130 µm × 16 µm pro Position, 25 ms Belichtungszeit, 30 × 1000 Lattice-Lichtblatt, zwei Kanäle.

Calcium-Signalling-Ereignisse laufen ultraschnell ab. Es ist eine echte Herausforderung, das gesamte Volumen eines Organoids schnell genug zu erfassen, um solche Ereignisse nicht zu versäumen.

ZEISS Lattice Lightsheet 7 ermöglicht zeitaufgelöste Aufnahmen des gesamten Organoids in hoher temporaler Auflösung, sodass das Aufblitzen des Calciums in einzelnen Zellen erfasst wird.

Ein Volumen alle 10 Sek. über 10 Min., 376 Ebenen pro Volumen, abgebildetes Volumen: 145 µm × 350 µm × 75 µm, 5 ms Belichtungszeit, 100 × 1800 Lattice-Lichtblatt.