ライフサイエンス研究における格子ライトシート顕微鏡 - 研究コミュニティでの最近の事例
技術応用

ライフサイエンス研究における格子ライトシート顕微鏡

研究コミュニティから最近の応用例を探索する

2020年にZEISS Lattice Lightsheet 7が研究コミュニティに発表されたとき、それは生命研究のための顕微鏡技術の発展におけるマイルストーンとなるものでした。生物学者たちは初めて、細胞内の生物学的プロセスを長期間に渡って観察する機会を手にし、高度なイメージング技術を、最大限の利用しやすさを前提に使いやすい装置に実装したのです。

現在、世界中の研究グループがこの技術を実際にテストし、初期の成果を挙げています。このページでは、格子ライトシート顕微鏡の恩恵を受ける幅広いアプリケーションと、ZEISS Lattice Lightsheet 7でしか得られない印象的な発見について説明しています:

発生中のマウス胚における遺伝子発現シグネチャー

生命の発達における初期過程を理解する

どちらの画像も、直径約60μmで3.5日目の固定された マウス胚 を示しています。スピニングディスク:試料は、γ-H2AXとEdU標識複製DNAを染色したもの;ZEISS Lattice Lightsheet 7:試料は、γ-H2AXとDRAQ5に対して染色されています。

画像ご提供:T. Olbrich and M. Kruhlak, National Cancer Institute, National Institutes of Health, USA.

着床前のマウス胚は、2つの重要な細胞運命決定を伴う一連の細胞分裂を次々と行います。この決定は、さらに発達する胚の複雑さと構造に影響を及ぼします。胚細胞がどのように生体分子的に初期発生の可能性を制限し、特定の細胞コミットメントを促進するのかを理解することは、がんの可塑性に関する重要な洞察を提供し、受精プロトコルを改善するのに一役買うことでしょう。

課題

未熟なエピブラストから多能性状態への移行中、100以上の細胞が直径約60-80μmの着床前マウス胚に組織化されます。この移行期における遺伝子発現の変化を調べる目的で、生きた試料と固定した試料の両方を、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて異なるタイムポイントで画像化しました。細胞発現パターンの容積解析により、着床前マウス胚の発生を制御する分子メカニズムの証拠がもたらされています。

どの細胞が特定の細胞マーカーを発現しているのか、またこれらの細胞が互いにどのように組織化されているのかを調べるには、共焦点顕微鏡による着床前胚のボリュームイメージングが必要となります。このステージの胚は、生育環境、構造的完全性、光毒性の変化に敏感な状態です。発生表現型の異常な変化を回避するため、胚をカバーガラスに押し付けることは許されず、光毒性の低い状態で迅速に画像化する必要がありました。唯一の選択肢は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を利用することでした。このイメージング法は、光毒性が低いというニーズを満たし、必要なスピードもほぼ確保できているものの、胚へのイメージング深度が深くなるにつれてシグナル輝度が劇的に低下するという問題がありました。その結果、一般的には試料の深さの半分しか撮影されていませんでした。

ソリューション

ZEISS Lattice Lightsheet 7顕微鏡は、光毒性がほとんどなく、モーションアーティファクトを防止するのに必要な速度で、シグナル輝度の損失を最小限に抑えながら、胚の全深度のイメージングを実現しました。加えて、ZEISS Lattice Lightsheet 7を用いた胚のボリュームイメージングでは、胚内の細胞組織をより正確に表現するために、ほぼ等方的な解像度が得られました。重要な点としては、このイメージング技術によって、胚発生の重要な段階における遺伝子発現シグネチャーの測定が可能になることでしょう。

画像取得パラメータ

イメージングボリューム:230 µm x 124 µm x 94 µm、露光時間 30 ms、30 x 1000 格子ライトシート、2チャネル。

生きた幹細胞由来の心筋細胞

心臓細胞の拍動による心血管疾患の研究

この動画は、ZEISS Lattice Lightsheet 7で取得した、SiR-HoechstでDNAを標識するために染色された iPS(人工多能性幹細胞)由来の心臓 細胞 のライブ映像です。

画像ご提供:Y. Taniguchi, Kyoto University, Japan.

谷口ラボでは、生物学、化学、物理学、医学、情報学など、複数の学問分野を融合した強みを生かした新技術の開発に力を入れており、彼らの学際的なアプローチと専門知識は、京都の大学における多くの研究グループとのコラボレーションを誘致しています。そのプロジェクトの1つでは、生きたiPS細胞(人工多能性幹細胞)由来の心筋細胞が、心臓血管研究のための貴重なツールであることが判明しています。これらの研究は、心血管疾患のモデル化、薬物試験の迅速化、潜在的な再生治療の進展に利用することができるでしょう。

 

課題

従来の共焦点顕微鏡では、拍動周波数以上の時間分解能で3D細胞モデル全体を画像化することはできませんでした。

ソリューション

ZEISS Lattice Lightsheet 7のサブセル解像度で高速ボリュームイメージングを行う機能は、特に細胞収縮力や生存率などの組織変化を調べるために活用することができます。

画像取得パラメータ

1.26秒毎に1体積、48 vol/minを1分間、イメージングボリューム:300 µm x 435 µm x 125 µm、2 µm ステップサイズ、1体積あたり126プレーン、露光時間 1 ms、100 x 1800 格子ライトシート。

困難なグリッド構造上の軸索成長円錐

神経細胞の発達と機能不全に関する洞察の獲得

ここでは、厚さ200µmのシクロオレフィンポリマー(COP)上に培養した マウス皮質ニューロン の分散培養を、グリッド構造で見ることができます。神経細胞は、mScarlet(細胞質)とLyn-tailed-EGFP(細胞膜)で標識されています。

画像ご提供:M. Kengaku, Kyoto University, Kyoto, Japan.

軸索成長円錐は環境を探索し、神経成長の方向を決定します。発達中の神経細胞に見られるダイナミックな動きを調べることで、神経疾患や神経変性疾患における神経の発達や機能不全をより深く理解することができます。

課題

グリッド構造を持つシクロオレフィンポリマー(COP)上で細胞を成長させ、成長円錐がグリッドに沿ってどのように進行するかを観察します。成長錐体は非常に光に敏感なため、励起光を浴びすぎると縮み始めます。さらに、COPのグリッド構造は、従来のイメージングシステムに多くの課題を投げかけています。従来のレーザー走査型共焦点の場合、二重の画像アーチファクトが見られることがあります。また、COPの屈折率が1.53で、ガラスの屈折率が1.52であるのに対して、COP底部の厚さは200μmであり、これらのパラメータが画像のブレの原因となる可能性があります。

ソリューション

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、このような課題を克服することができます。グリッド構造を格子ライトシートと平行になるように配向し、格子ライトシート7特有の自由形状光学系を調整することで、二重像を除去することが可能となります。さらに、ZEISS Lattice Lightsheet 7の柔らかさが、発達中のニューロンのダイナミックな動きを、過剰な光で妨害しないため、高い時空間解像度において4D調査する際に最適なツールとなります。

画像取得パラメータ

15秒ごとに1体積、5分間で21体積、イメージングボリューム:カー78 µm x 44 µm x 22 µm、0.3 µm ステップサイズ、1体積あたり134プレーン、露光時間 20 ms、30 x 1000 格子ライトシート、2チャネル。

ヒト多能性幹細胞のコロニー

再生医療のための有望なツール

ここでは、 ヒト胚性幹細胞由来の脊髄オルガノイド を、細胞培養培地とマトリゲルの中で、EGFPタグ付きタイトジャンクション、核内mCherry、SiR-アクチンの遠赤色色素で標識したものを見ることができます。

このタイムラプスは、緑色蛍光タンパク質(TJP1-GFP)と融合したタイトジャンクションタンパク質1を発現するヒト多能性幹細胞(hPSC)のコロニーをマイクロパターン化したものです。これらのコロニーは、細胞外マトリックスの添加に応じて、中空の三次元球体に折りたたまれたものです。この例では、上皮性hPSCの先端側に局在するタイトジャンクションのレポーターによって、折りたたみのプロセスが可視化されています。

画像ご提供:G. Anand, S. Ramanathan, Harvard University, USA.

Ramanathanラボでは、細胞や生物による意思決定の解明を目指して研究を進めています。研究の焦点のひとつは、多能性幹細胞がどのように発生を決定し、人体の複雑な組織を形成するのか、ということです。ヒト多能性幹細胞は、細胞の分化を研究するための貴重なツールです。細胞は無限に再生し、体内においてあらゆる種類の他の細胞に成長することができるため、損傷した細胞や病気の細胞を置き換える可能性を秘めており、再生医療の有望な手段となり得るのです。

課題

共焦点顕微鏡を用いた以前の実験では、フォトブリーチと光毒性の論点がデータ収集に問題を引き起こしていました。

ソリューション

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、球体のボリュームイメージングを実現し、細胞の分裂と再配列を追跡できるようになりました。

画像取得パラメータ

10分ごとに1体積を16時間、97体積を記録、イメージングボリューム:520 µm x 540 µm x 32 µm、露光時間 12ms、100 x 1800 格子ライトシート。

私たちは、ZEISS Lattice Lightsheet 7を評価することで、従来の共焦点顕微鏡で蛍光レポーター細胞株を高時間分解能で画像化しようとした際に経験したフォトブリーチや光毒性の問題を克服できるかどうかを確認することに関心を持っていました。また、この装置を用いて5分以下の時間スケールで細胞のダイナミックな動きをキャプチャできることに、嬉しい驚きを感じました。ZEISSの最新技術を使用して、試料を撮像する機会を得られたことに感謝しています。

Giridhar Anand

Ramanathan Lab, Harvard University, USA

細胞内の詳細な分裂イベント

ミトコンドリアとアクチン細胞骨格の関連を探る

この動画では、アクチン(緑色)を標識するLifeAct-GFPと、ミトコンドリア(青色)を標識するTom20-mCherryを発現させた HeLa細胞 を映し出しています。

ミトコンドリアが細胞のさまざまな領域に局在するのは、アクチン細胞骨格を介しているためです。私たちは、このプロセスを支配する分子メカニズムを研究しており、増殖細胞におけるミトコンドリアと作用細胞骨格との相互作用を観察することを目標としています。

課題

従来の共焦点顕微鏡を使用した場合、これらの試料で光毒性が観察されます。

ソリューション

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、分裂イベント中であっても、アクチンと各ミトコンドリアを画像化するのに十分な解像度において、12時間の細胞イメージングを実現します。

画像取得パラメータ

5つの位置で、10分ごとに1体積を12時間、73体積を記録、イメージングボリューム:75 µm x 120 µm x 16 µm/位置、露光時間 30 ms、30 x 1000 格子ライトシート、3チャネル。

脳のオルガノイド

神経疾患や神経変性疾患を研究する上での脳のシミュレーション

この動画は、 脳のオルガノイド を撮影したものです。 画像ご提供:Maria La Calle Aurioles, McGill University, Montreal, Canada.

脳のオルガノイドは、幹細胞由来の自己組織化された三次元組織構造で、ヒトの脳の構造や機能をシミュレートすることができます。これらは脳、神経疾患、神経変性疾患の研究に広く用いられています。

課題

従来の共焦点顕微鏡法では、脳の器官全体を合理的な時間で画像化するためには、速度か解像度のどちらかを妥協しなければなりませんでした。

ソリューション

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、各ニューロンを識別するのに十分な解像度で、10分以内にオルガノイド全体を画像化します。

画像取得パラメータ

イメージングボリューム:1.37 mm x 1.18 mm x 76 µm, 露光時間 5 ms、100 x 1800 格子ライトシート、2チャネル。

ゼブラフィッシュの分節間血管

ゼブラフィッシュ胚における心血管系の発達を解明する

これは、血管を標識するdsRed(紫色)とカルシウムシグナルを測定するGCaMP/GFP(緑色)を発現している、6日目の生きた ゼブラフィッシュ です。

画像ご提供:J. Mack, University of California, Los Angeles, USA.

Mackラボでは、血管の健康と疾患における内皮のメカノトランスダクションのメカニズムを、血流の力が血管反応にどのような影響を与えるかについて、単一細胞レベルと組織レベルの両側面において研究しています。反応の不均一性を可視化する方法として、彼らは高解像度のライブセルイメージングと原子間力顕微鏡を利用し、Ca2+振動のダイナミクスを定量化し、フローによって誘導される細胞膜の特性を測定するとともに、細胞内レベルにおけるタンパク質の局在を決定しています。1

ゼブラフィッシュは短期間に繁殖し、透明な胚を持ち、遺伝子操作が容易であるため、心臓血管の研究に広く用いられているモデル生物です。Mackラボでは、ゼブラフィッシュを利用して心臓血管の発生、機能、疾患の研究を行っています。 

課題およびソリューション

ワイドフィールド顕微鏡は、血管内皮細胞のライブイメージングに必要なスピードを実現することができますが、より高い解像度、特に軸方向の解像度を達成することができるのは、ZEISS Lattice Lightsheet 7のみです。

画像取得パラメータ

8秒ごとに1体積を15分間、115体積を記録、イメージングボリューム:200 µm x 250 µm x 55 µm、露光時間 3 ms、100 x 1800 格子ライトシート、2チャネル。

がん細胞における膜のラフリング

腫瘍細胞の運動性と転移能の特徴

この動画は、GFPが膜に発現している がん細胞 を映し出しています。

画像ご提供:I. Smith, University of California, Irvine, USA.

膜のラフリングは、接着細胞の前縁でしばしば観察される、細胞表面膜のダイナミックな動きです。がん細胞において、膜のラフリングは腫瘍細胞の運動性や転移の可能性を特性評価する際に利用されます。

課題およびソリューション

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、超高速膜ダイナミクスのボリュームイメージングをほぼ等方的な解像度で可能にし、膜ラフリングの詳細な特性評価を実現します。

画像取得パラメータ

1.5秒ごとに1体積を2分間、85体積を記録、イメージングボリューム:58 µm x 60 µm x 9 µm、露光時間 3 ms、15 x 550 格子ライトシート。

生きた線虫の神経標識

線虫を利用した神経変性ヒト疾患の研究

ここでは、種々の神経ラベルされた 線虫 を見ることができます。

画像ご提供:S. Encalada, The Scripps Research Institute, and S. Chalasani, Salk Institute, La Jolla, USA.

Encaladaラボは、ニューロンの軸索輸送を制御する分子モーターとその小胞カーゴとの相互作用の特徴づけに関心を持っており、そこで用いられているツールのひとつが、モーターカーゴ制御複合体を同定し、その特徴を明らかにする線虫の高解像度顕微鏡検査です。また、線虫を用いてプリオン病やアルツハイマー病などのタンパク質凝集疾患モデルを構築し、毒性や感染性におけるモーターベースの輸送の役割についても明らかにしています。1

Chalasaniラボでは、線虫の単純な神経系を利用して、よく理解されたモデルでヒトの病気や薬剤のテストを研究しています。2

課題

線虫全体の神経細胞をイメージングするには、大容量の超高速イメージングが必要であり、従来の共焦点顕微鏡のような技術では困難なものでした。

ソリューション

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、必要となる時間分解能だけでなく、移動するワームの中から個々のニューロンを識別して追跡するための空間分解能も発揮します。

画像取得パラメータ

2分ごとに1体積を1時間20分、41体積を記録、イメージングボリューム:300 µm x 340 µm x 55 µm、露光時間 15 ms、100 x 1800 格子ライトシート、2チャネル。

メラノーマ細胞を標的とする細胞傷害性T細胞

免疫療法を最適化するためのT細胞の挙動研究

これらの動画は、 細胞傷害性Tリンパ球マウスのメラノーマ標的細胞 と相互作用する様子を示しています。リンパ球はCellVue Maroonで染色され、標的細胞はF-アクチン・レポーターであるF-トラクチンEGFPを発現しています。

画像ご提供:Elisa Sanchez, Morgan Huse, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, Weill Cornell Medicine, New York, USA.

Huseラボは、免疫細胞がどのようにコミュニケーションをとるかについて関心を持っています。感染症やがんに対する効果的な免疫応答には、免疫細胞が適切な場所に移動し、他の細胞と物理的に相互作用することによって脅威を特定し、特異的に反応することが必要です。T細胞は表面の受容体刺激に応答して、数分のうちにその構造を完全に再編成することができます。当ラボでは、T細胞の構造を制御するシグナル伝達メカニズムや、特定の細胞構造が免疫機能にどのように寄与しているかを研究しています。これらの問題をよりよく理解することは、免疫療法など、生体内での免疫反応をよりうまく調節する戦略の開発に役立つ可能性を秘めています。1

免疫療法の効果を最適化するためには、T細胞がどのようにがん細胞を認識し、死滅させるかを理解することが極めて重要です。

課題およびソリューション

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、T細胞を生きたままの状態でキャプチャします。細胞間相互作用の高速で穏やかなボリュームイメージングを、ほぼ等方的な解像度で行うことで、T細胞の挙動と機能を研究するための完璧なツールとなります。

画像取得パラメータ

3つの位置、 3分ごとに1体積で2時間15分間、1体積あたり 507 プレーン、イメージングボリューム:300 µm x 130 µm x 16 µm/ポジション、露光時間 25 ms、30x1000 格子ライトシート、2チャネル。

膵臓がんオルガノイド

がん研究におけるカルシウムシグナル

ここでは、カルシウム指示薬GCaMP6sで染色した 膵臓がんオルガノイド を見ることができます。

画像ご提供:Michiyuki Matsuda and Sinya Yamahira, Kyoto University, Japan.

がん研究において、カルシウムシグナル伝達の変化は腫瘍の成長と進行に関係しているとされてきました。GCaMPは遺伝的にコードされたカルシウムインジケータで、カルシウムと結合すると緑色に蛍光を発します。したがって、GCaMPは細胞内Ca2+の増加を測定し、カルシウムシグナル伝達を研究する目的で一般的に用いられています。

課題

カルシウムシグナル伝達イベントは超高速イベントであることが知られており、そのようなイベントを見逃さないよう、オルガノイドの全容積を迅速にキャプチャすることは困難です。

ソリューション

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、高い時間分解能でオルガノイド全体のタイムラプスイメージングを実現し、個々の細胞のカルシウムフラッシュをキャプチャすることができます。

画像取得パラメータ

10秒ごとに1体積で10分間、1体積あたり 376プレーン、イメージングボリューム:145 µm x 350 µm x 75 µm、露光時間 5 ms、100 x 1800 格子ライトシート。

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