ライフサイエンス研究における格子ライトシート顕微鏡

未熟なエピブラストから多能性状態への移行中、100以上の細胞が直径約60～80 μmの着床前マウス胚に組織化されます。この移行期における遺伝子発現の変化を調べる目的で、生きた試料と固定した試料の両方を、スピニングディスク共焦点顕微鏡を用いて異なるタイムポイントでイメージングしました。細胞発現パターンの容積解析により、着床前マウス胚の発生を制御する分子メカニズムの証拠が得られました。

どの細胞が特定の細胞マーカーを発現しているのか、またこれらの細胞が互いにどのように組織化されているのかを調べるには、共焦点顕微鏡による着床前胚のボリュームイメージングが必要となります。このステージの胚は、生育環境、構造的完全性、光毒性の変化に敏感な状態です。発生表現型の異常な変化を回避するため、胚をカバーガラスに押し付けることは許されず、光毒性の低い状態で迅速にイメージングする必要がありました。唯一の選択肢は、スピニングディスク共焦点顕微鏡を利用することでした。このイメージング法は、光毒性が低いというニーズを満たし、必要なスピードもほぼ確保できているものの、胚へのイメージング深度が深くなるにつれてシグナル輝度が劇的に低下するという問題がありました。その結果、一般的には試料の深さの半分しか撮影されていませんでした。

ZEISS Lattice Lightsheet 7顕微鏡は、光毒性がほとんどなく、モーションアーティファクトを防止するのに必要な速度で、シグナル輝度の損失を最小限に抑えながら、胚の全深度のイメージングを実現しました。加えて、ZEISS Lattice Lightsheet 7を用いた胚のボリュームイメージングでは、ほぼ等方的な分解能が得られ、胚内の細胞組織がより正確に表現されました。重要な点は、このイメージング技術によって、胚発生の重要な段階における遺伝子発現シグネチャーの測定が可能になるということです。

イメージングボリューム：230 µm x 124 µm x 94 µm、露光時間30 ms、30 x 1000格子ライトシート、2チャネル。

従来の共焦点顕微鏡では、拍動周波数以上の時間分解能で3D細胞モデル全体をイメージングすることはできませんでした。

ZEISS Lattice Lightsheet 7では、サブセルラーレベルの分解能で高速ボリュームイメージングを行うことができ、特に細胞収縮力や生存率などの組織変化を調べるのに活用できます。

1.26秒毎に1ボリューム、48ボリューム/分を1分間、イメージングボリューム：300 µm x 435 µm x 125 µm、2 µm ステップサイズ、1ボリュームあたり126プレーン、露光時間 1 ms、100 x 1800 格子ライトシート。

グリッド構造を持つシクロオレフィンポリマー（COP）上で細胞を成長させ、成長円錐がグリッドに沿ってどのように進行するかを観察します。成長錐体は非常に光に敏感なため、励起光を浴びすぎると縮み始めます。さらに、COPのグリッド構造は、従来のイメージングシステムに多くの課題を投げかけています。従来のレーザー走査型共焦点の場合、二重の画像アーチファクトが見られることがあります。また、COPの屈折率が1.53で、ガラスの屈折率が1.52であるのに対して、COP底部の厚さは200 μmであり、これらのパラメータが画像のブレの原因となる可能性があります。

ZEISS Lattice Lightsheet 7なら、このような課題を克服できます。グリッド構造を格子ライトシートと平行になるように配向し、Lattice Lightsheet 7特有の自由形状光学系を調整することで、二重像を除去することが可能となります。さらに、ZEISS Lattice Lightsheet 7の低ダメージなイメージングは、発達中のニューロンのダイナミックな動きを過剰な光で妨害しないため、高い時空間分解能で4D観察を行う際に最適なツールです。

15秒ごとに1ボリューム、5分間で21ボリューム、イメージングボリューム：78 µm x 44 µm x 22 µm、0.3 µmステップサイズ、1ボリュームあたり134プレーン、露光時間20 ms、30 x 1000格子ライトシート、2チャネル。

共焦点顕微鏡を用いた以前の実験では、フォトブリーチと光毒性の論点がデータ収集に問題を引き起こしていました。

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、球体のボリュームイメージングを実現し、細胞の分裂と再配列を追跡できるようになりました。

10分ごとに1ボリュームを16時間、97ボリュームを記録、イメージングボリューム：520 µm x 540 µm x 32 µm、露光時間12 ms、100 x 1800格子ライトシート。

従来の共焦点顕微鏡を使用した場合、これらの試料で光毒性が観察されます。

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、分裂イベント中であっても、アクチンと各ミトコンドリアをイメージングするのに十分な分解能で、12時間の細胞イメージングを可能にします。

5つの位置で、10分ごとに1ボリュームを12時間、73ボリュームを記録、イメージングボリューム：75 µm x 120 µm x 16 µm/位置、露光時間30 ms、30 x 1000格子ライトシート、3チャネル。

従来の共焦点顕微鏡法では、脳の器官全体を合理的な時間でイメージングするためには、速度か分解能のどちらかを妥協しなければなりませんでした。

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、各ニューロンを識別するのに十分な分解能で、10分以内にオルガノイド全体をイメージングします。

イメージングボリューム：1.37 mm x 1.18 mm x 76 µm、露光時間5 ms、100 x 1800格子ライトシート、2チャネル。

ワイドフィールド顕微鏡は、血管内皮細胞のライブイメージングに必要なスピードを実現することができますが、より高い分解能（特に軸方向）を達成することができるのは、ZEISS Lattice Lightsheet 7のみです。

8秒ごとに1ボリュームを15分間、115ボリュームを記録、イメージングボリューム：200 µm x 250 µm x 55 µm、露光時間3 ms、100 x 1800格子ライトシート、2チャネル。

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、超高速膜ダイナミクスのボリュームイメージングをほぼ等方的な分解能で可能にし、膜ラフリングの詳細な特性評価を実現します。

1.5秒ごとに1ボリュームを2分間、85ボリュームを記録、イメージングボリューム：58 µm x 60 µm x 9 µm、露光時間3 ms、15 x 550格子ライトシート。

線虫全体の神経細胞をイメージングするには、大容量の超高速イメージングが必要であり、従来の共焦点顕微鏡のような技術では困難なものでした。

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、必要となる時間分解能だけでなく、移動するワームの中から個々のニューロンを識別して追跡するための空間分解能も発揮します。

2分ごとに1ボリュームを1時間20分、41ボリュームを記録、イメージングボリューム：300 µm x 340 µm x 55 µm、露光時間15 ms、100 x 1800格子ライトシート、2チャネル。

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、T細胞を生きたままの状態で捉えます。細胞間相互作用の高速で穏やかなボリュームイメージングを、ほぼ等方的な分解能で行うことから、T細胞の挙動と機能を研究するのに最適なツールです。

3つの位置、3分ごとに1ボリュームで2時間15分間、1ボリュームあたり507プレーン、イメージングボリューム：300 µm x 130 µm x 16 µm/位置、露光時間25 ms、30 x 1000格子ライトシート、2チャネル。

カルシウムシグナル伝達イベントは超高速なイベントであることが知られており、そのようなイベントを見逃さないよう、オルガノイドの全ボリュームを迅速に捉えることは困難です。

ZEISS Lattice Lightsheet 7は、高い時間分解能でオルガノイド全体のタイムラプスイメージングを実現し、個々の細胞のカルシウムフラッシュを捉えることができます。

10秒ごとに1ボリュームで10分間、1ボリュームあたり376プレーン、イメージングボリューム：145 µm x 350 µm x 75 µm、露光時間5 ms、100 x 1800格子ライトシート。