ZEISS Lightsheet 7​
製品

ZEISS Lightsheet 7

生体試料と透明化試料のライトシートマルチビューイメージング

ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)は、生体モデル生物の個体、組織または細胞が成長する様子を高速かつ低ダメージで長時間にわたりイメージングするのに最適です。ZEISS Lightsheet 7を使用すれば、光学的に透明化処理を施した大型試料をサブセルラーレベルの分解能でイメージングできます。専用の光学系、試料チャンバー、ホルダーは、選択した透明化処理法の屈折率に合わせることが可能です。

  • 高速かつ高感度で本来の姿を観察
  • 任意の透明化溶液で大型試料をイメージング
  • 多様なアプリケーションで最高レベルの画質を実現
シロイヌナズナの花の発生。ご提供:Riha lab, CEITEC, Masaryk University, Brno, Czech Republic

生態活動の観察 

高速かつ高感度

量子効率の高い検出器により、最最低限の照明光レベルで最速のプロセスを観察できます。これにより、生体試料に励起光による悪影響を与えることなく、試料の実態を観察することが可能になります。特殊な試料チャンバーが、加熱や冷却、CO2など、実験に最適な環境を維持します。

キャプション: シロイヌナズナの花の発生。ご提供:Riha lab, CEITEC, Masaryk University, Brno, Czech Republic

大型試料のイメージング

任意の透明化溶液を使用可能

透明化処理の方法は組織の種類、蛍光標識、試料自体のサイズによって異なります。Lightsheet 7は、これらの異なる条件のすべてをカバーできるように設計されています。1.33〜1.58の屈折率やほぼすべての透明化溶液で、最大2 cmの試料をイメージングできるようになりました。光学的に透明化処理を施したオルガノイド、スフェロイド、器官、脳、またはその他の試料に関わらず、サブセルラーレベルの分解能のオーバービュー画像およびデータを取得することが可能です。

 

動画:C57 BL6JマウスにPBS、CellTracker™ CM-DiI色素および4% PFAを灌流。iDISCO+プロトコルを用いて透明化処理を施し、最終RIMSにはケイ皮酸エチルを使用。試料ご提供:Erin Diel – Harvard University; Harvard Center for Biological Imaging Room 2052, 16 Divinity Ave, Cambridge, MA 02138, USA

ZEISS Lightsheet 7専用の光学系

優れた画質を実現

多様なアプリケーションに対応

LSFMイメージングをさらに進化させ、幅広いアプリケーションに対応しましょう。特別な光学系と試料チャンバーにより、完璧な屈折率に調整することができます。ライトシートと試料の位置、ズーム設定、タイルと多点、データ処理パラメーターなどのイメージングパラメーターをスマートソフトウェアツールで調整可能です。特許取得済みのピボットスキャンテクノロジーを用いて、アーチファクトのない光学セクションを最高の画質で取得できます。

ZEISS Lightsheet 7の内部を見る

  • 生体/透明化処理済み試料をいかに簡単に配置・イメージングできるかをご覧ください。

ライトシート蛍光顕微鏡の原理​

Lightsheet 7 LSFMの照射原理

ライトシート蛍光顕微鏡の原理​

そして分かれた検出光学系と照明光学系により、検出分解能と感度を犠牲にすることなく、低開口数の専用レンズでの蛍光励起が可能になります。このためLSFMは、成長中の生体試料や、透明化処理を施した大型組織試料など、ミリメートル単位の試料のイメージングに最適です。

ライトシート蛍光顕微鏡の原理​

ライトシート蛍光顕微鏡(LSFM)は、蛍光の励起と検出を2つの独立した光路に分割し、照明軸は検出軸に対して垂直になります。つまり、試料の単一薄片を一度に照明し、焦点面からの蛍光のみを励起することで、固有の光学切片像を作成できます。ピンホールや画像処理は不要です。焦点面からの光は、共焦点顕微鏡やその他のレーザー走査型顕微鏡のようにピクセルごとではなく、カメラのピクセルに集光されます。カメラベースの検出器で画像収集を並列化することで、他の多くの顕微鏡技術よりも少ない励起光で画像をより速く収集できます。これにより、3Dイメージングの超高速化と光量の効率化を実現できます。

そして分かれた検出光学系と照明光学系により、検出分解能と感度を犠牲にすることなく、低開口数の専用レンズでの蛍光励起が可能になります。このためLSFMは、成長中の生体試料や、透明化処理を施した大型組織試料など、ミリメートル単位の試料のイメージングに最適です。

特許取得済みのピボットスキャナー

均一な照明を実現​

特許取得済みのピボットスキャナーが均一な照射を実現​
特許取得済みのピボットスキャナーが均一な照射を実現​

ライトシートが試料を通過する際、試料のいくつかの構造、例えば核などは、励起光を吸収または散乱します。これは左の図に示すように、照明軸に沿って影を落とします。この効果はすべての蛍光顕微鏡で発生しますが、ライトシート蛍光顕微鏡の照明軸は観察軸に対して垂直であるため、効果がよりはっきりとわかります。 ​

Lightsheet 7では、特許取得済みのピボットスキャナーが画像取得中にライトシートの角度を上下に変更します。照明角度を変更すると、右の図に示すように、影は様々な方向に投影され、励起光は不透明な構造の背後の領域にも到達します。これにより、アーチファクトのない画像を取得し、画像の後処理および解析ステップを改善することができます。

アプリケーション

ZEISS Lightsheet 7のアプリケーション例

  • マウスの腎臓をiDISCOで透明化処理し、ケイ皮酸エチルとLightsheet 7検出光学系5x / 0.16 focを用いてイメージング。
  • 試料ご提供:U. Roostalu, Gubra, Denmark
  • 試料ご提供:U. Roostalu, Gubra, Denmark

腎臓学

マウス腎臓をiDISCOプロトコルで透明化し、ZEISS Lightsheet 7 検出光学系 5x / 0.16 focおよびClr 20x / 1.0 nd = 1.53(挿入図)を使用してケイ皮酸エチルでイメージングしました。赤:マウスにDyLight 594結合トマトレクチンを灌流し、血管系と糸球体を視覚化。緑:組織の解剖学的構造を視覚化する自家蛍光。3D臓器全体のイメージングとコンピューター画像解析により糸球体のサイズと数を調べることで、様々な腎臓病のメカニズム(糖尿病性腎症など)をより適正に把握できます。画像はACQUIFER HIVEデータプラットフォーム上のarivis Vision4D®で処理しました。

  • 機械感覚神経線維の解剖学的組織を示すP10マウス気管の3Dデータセット。
  • 機械感覚神経線維の解剖学的組織を示すP10マウス気管の3Dデータセット。
  • 試料ご提供:P.-L. Ruffault, C. Birchmeier, Laboratory of Developmental Biology / Signal Transduction; A. Sporbert, M. Richter Advanced Light Microscopy; M. Delbrück, Center for Molecular Medicine, Berlin, Germany
  • 試料ご提供:P.-L. Ruffault, C. Birchmeier, Laboratory of Developmental Biology / Signal Transduction; A. Sporbert, M. Richter Advanced Light Microscopy; M. Delbrück, Center for Molecular Medicine, Berlin, Germany

発生生物学

機械感覚神経線維の解剖学的組織を示すP10マウス気管の3Dデータセット。染色:DAPI、コラーゲンIV(Alexa 488抗体)、感覚線維(tdTomatoを発現するレポーター株、Alexa 555抗体)、神経フィラメントタンパク質NF200(有髄神経線維、Alexa 647抗体)。

試料はPEGASOS(Jing et al, 2018, Cell Research)で透明化され、BB-PEGで、RI 1.54、5x / 0.16のfoc検出光学系、Clr 20x / 1.0 nd = 1.53でイメージングされました。5倍率データセット:ピクセルスケーリング 0.61 x 0.61 x 1.63 µm、3 x 3タイル、ズーム1.5倍、1230 zセクション、画像の大きさ 2.57 x 2.58 x 2 mm、20倍率データセット:ピクセルスケーリング 0.23 x 0.23 x 0.58 µm、1 x 5タイル、ズーム1.0倍、4206 zセクション、体積 2.0 x 0.45 x 1.82 mm。

  • 試料ご提供:W. Masselink, Tanaka lab, Research Institute of Molecular Pathology, IMP画像ご提供:P. Pasierbek, K. Aumayr, IMP BioOptics, Vienna, Austria

脊椎動物の肢、脊髄の再生

サンショウウオは、手足と脊髄を再生する驚くべき能力を持っています。分子遺伝学ツールを使用すると、この複雑な再生の原因となる幹細胞と、増殖を開始する損傷応答シグナルを特定できます。 このメキシコサンショウウオ前腕は、ケイ皮酸エチル(Masselink, W. et al, Development 146, (2019))で透明化され、1.57の屈折率で5x / 0.16 focの検出光学系でイメージングされました。マルチタイルデータセットは、ACQUIFER HIVEデータプラットフォーム上のZENイメージングソフトウェアとarivis Vision4D®ソフトウェアで調整、融合、レンダリングされました。

  • 試料ご提供:D. Reumann and J. Knoblich, IMBA, Vienna, Austria

神経形態学

ニューロンは非常に複雑な形態をしており、臓器全体へ広がっているため、ヒトの脳内の細胞全てをイメージングするのはほぼ不可能です。オルガノイドは、神経幹細胞培養からのニューロンの産生を含め、ヒトの脳の再現をある程度まで可能にします。ECiで透明化すると、ニューロンの形態をローカルレベルからグローバルレベルまで調査できます。これにより3Dでのニューロンの形態研究の可能性が飛躍的に広がります。

GFP / tdtomato(3% GFPおよび3% tdtomato)でまばらに標識された35日齢のニューロンオルガノイド。Clr 20x / 1.0 nd = 1.53対物レンズでイメージング。
ピクセルスケーリング:222 x 222 x 567 nm。
画像ボリューム:1.66 x 0.66 x 1.6 mm。

  • ZEISS Lightsheet、5x/0.16対物レンズ(ボリューム:2.5 x 2.5 x 1.6 mm)を用いて、屈折率1.49(ph 7)でCeによる透明化処理後に3Dイメージング(Li et al. PNAS 163, 2017)。標識は黄色。GFP-CD8 T細胞、シアン:B220(B細胞濾胞、Alexa555)、マゼンタ:CD31(脈管構造、Alexa647)
    ZEISS Lightsheet、5x/0.16対物レンズ(ボリューム:2.5 x 2.5 x 1.6 mm)を用いて、屈折率1.49(ph 7)でCeによる透明化処理後に3Dイメージング(Li et al. PNAS 163, 2017)。標識は黄色。GFP-CD8 T細胞、シアン:B220(B細胞濾胞、Alexa555)、マゼンタ:CD31(脈管構造、Alexa647) Joanna Groom, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Australia
    Joanna Groom, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Australia

    ZEISS Lightsheet、5x/0.16対物レンズ(ボリューム:2.5 x 2.5 x 1.6 mm)を用いて、屈折率1.49(ph 7)でCe3Dによる透明化処理後にイメージング(Li et al. PNAS 163, 2017)。

    標識は黄色。GFP-CD8 T細胞、シアン:B220(B細胞濾胞、Alexa555)、マゼンタ:CD31(脈管構造、Alexa647)

    試料ご提供:Joanna Groom, The Walter and Eliza Hall Institute of Medical Research, Australia

免疫学

無傷のリンパ器官を3Dでイメージングすることにより、ウイルス感染に対する免疫応答を解析および定量化できます。採取前に、T細胞を野生型宿主マウスに移植しました。5x / 0.16検出光学系(ボリューム:2.5 x 2.5 x 1.6 mm)を用いて、RI = 1.49(ph 7)でイメージングする前に、洗浄、固定、Ce3Dによる透明化処理した結節(Li et al. PNAS 163, 2017)。この画像は、GFP標識されたネイティブCD8+T細胞(黄色)、B細胞卵胞がB220(シアン)とCD31血管網(マゼンタ)を示しています。

  • C57 BL6JマウスにPBS、CellTracker™ CM-DiI色素および4% PFAを灌流。iDISCO+プロトコルを用いて透明化処理を施し、最終RIMSにはケイ皮酸エチルを使用。
  • C57 BL6JマウスにPBS、CellTracker™ CM-DiI色素および4% PFAを灌流。iDISCO+プロトコルを用いて透明化処理を施し、最終RIMSにはケイ皮酸エチルを使用。
  • 試料ご提供:E. Diel, D. Ric hardson, Harvard University, Cambridge, USA
  • 試料ご提供:E. Diel, D. Ric hardson, Harvard University, Cambridge, USA

マウス脳全体の血管系のマッピング

C57 BL6JマウスにPBSと4% PFAを灌流。CellTracker™ CM-DiI色素(血管膜を標識する脂質色素)を灌流して、脳を染色。最終RIMSとしてケイ皮酸エチルで平衡化したiDISCO+プロトコルを使用して、試料を透明化。次に、Translucence Bisystems社のメゾスケールイメージングチャンバー内で検出光学系Fluar 2.5x / 0.12を用いて、RI = 1.565のケイ皮酸エチルでイメージング。

右側の高解像度の挿入画像は、Clr Plan-Neofluar 20x / 1.0 Corr nd = 1.53で取得。ピクセル解像度1.83 x 1.83 x 6.77 µmでの画像ボリュームは、13.1 x 13.1 x 6 mm。4 x 4タイル、866のzセクションで約40分で取得。データボリュームは93 GB。 データは、ZENイメージングソフトウェアとACQUIFER HIVEデータプラットフォーム上のarivis Vision4D® で処理。

  • 試料ご提供:E. Diel, D. Richardson,Harvard University, Cambridge, USA

マウス脳全体の介在ニューロンとプルキンエ細胞のマッピング

PV-tdtomatoマウスの脳は、CLARITYプロトコルを使用して透明化され、最終イメージングは​​屈折率RI = 1.46でのEasyIndexで行われました。

tdtomatoの発現するパルブアルブミン-Creは、脳全体の介在ニューロンの集団および小脳のプルキンエ細胞で発現します。脳全体のデータセットは、検出光学系5x / 0.16 focのZEISS Lightsheet 7で取得しました。ピクセル解像度0.91 x 0.91 x 5.35 µm(12028 x 22149 x 1621ボクセル)での画像の大きさは11 x 20 x 8.8 mmです。6 x 10タイル、1621のzセクションで取得しました。データボリュームは1.2 TB(スティッチング後は805 GB)です。データは、ACQUIFER HIVEデータプラットフォーム上のZENイメージングソフトウェアとarivis Vision4D®で処理されました。

ダウンロード

    • ZEISS Lightsheet 7

      ライトシート蛍光顕微鏡:生体試料と透明化試料のためのマルチアングルイメージング

      ページ: 26
      ファイルサイズ: 3 MB
    • ZEISS Lightsheet 7

      Light sheet fluorescence microscopy for Multiviewimaging of living and cleared specimens.

      ページ: 4
      ファイルサイズ: 1 MB
    • How to Get Better Fluorescence Images with Your Widefield Microscope.

      A Methodology Review

      ページ: 11
      ファイルサイズ: 1 MB
    • ZEISS Lightsheet 7

      How to Get Best Images with Various Types of Immersion Media and Clearing Agents

      ページ: 10
      ファイルサイズ: 2 MB

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