Aplicaciones de Array TomographyCourtesy of D. Sherrier, J. Caplan, and S. Modla, University of Delaware, USA
Courtesy of D. Sherrier, J. Caplan, and S. Modla, University of Delaware, USA
Resumen

Aplicaciones de Array Tomography

Descubra ejemplos innovadores

Array Tomography (AT) es un enfoque potente para generar conjuntos de datos en 3D con una resolución a nanoescala. La muestra se secciona en varios cientos de cortes individuales y se obtienen imágenes de cada uno de ellos a alta resolución mediante microscopía electrónica de barrido.

Como enfoque no destructivo, las secciones finas de la muestra se mantienen en el sustrato de captura de imágenes y pueden seguir estudiándose con otros métodos, como la microscopía de fluorescencia u otros métodos analíticos.

No es necesario disponer de equipos especializados, lo que hace que este método de EM de volumen (vEM) resulte muy accesible para cualquier laboratorio que disponga de un microscopio electrónico de barrido (SEM) estándar y un ultramicrótomo. Estas características de AT lo convierten en un valioso método para la exploración de muestras tan diversas como células, tejidos y plantas, como demuestran estos ejemplos.

Comprender la conectividad en el tejido cerebral

Explorar millones de conexiones neuronales para comprender mejor las vías de señalización del cerebro.

Imagen general del cerebro de un mono capturada con AT.

Imagen general del cerebro de un mono capturada con AT.

El cerebro es un órgano complejo con millones de conexiones neuronales y vías de señalización. Comprender la relación entre la estructura y la función del tejido neuronal ayuda a aclarar parte de esta complejidad para poder entender mejor cómo funciona el cerebro y, a largo plazo, cómo tratar las disfunciones con intervenciones médicas.

Imagen de alta resolución del cerebro de un mono captada con SEM.

Imagen de alta resolución del cerebro de un mono captada con SEM.

Cuando se pretende explorar los millones de conexiones neuronales, se requiere un enfoque de captura de imágenes en 3D de alta resolución. En el caso de muestras pequeñas de cerebro, el tiempo necesario para capturar un conjunto completo de datos en 3D es considerable, pero factible. Sin embargo, cuando se aumenta considerablemente el tamaño del tejido, como es el caso del cerebro de un ratón o un mono, es necesario ampliar la captura de imágenes para generar los conjuntos de datos en 3D de alta resolución en un plazo de tiempo realista. Esto es posible gracias a AT.

Vasculatura cerebral de mono captada con AT.

Vasculatura cerebral de mono captada con AT.

ZEISS Atlas 5 Array Tomography es una herramienta de hardware/software que puede captar automáticamente imágenes de secciones en serie del sustrato con una resolución nanométrica. Este flujo de trabajo único es fácil de usar y se ha diseñado específicamente para que la captura de imágenes automatizada permita visualizar en 3D los grandes volúmenes necesarios para comprender las vastas conexiones del tejido cerebral.

Imagen a gran escala adquirida automáticamente de una muestra de cerebro de mono que muestra la vasculatura cerebral. Imagen captada con Atlas 5 Array Tomography. Campo de visión: 3700 mm

Mosaico unido de >1000 imágenes que muestran el cerebro de un mono. Cada imagen en mosaico tiene 4096 x 4096 píxeles, con un tamaño de píxel de 150 nm.

Unión automatizada de estas imágenes en mosaico para calcular una imagen del cerebro de mono con un campo de visión amplio.

Sección ultrafina de cerebro de ratón

Sección ultrafina de cerebro de ratón

Sección ultrafina de cerebro de ratón

Sección ultrafina de cerebro de ratón. Muestra: Cortesía de J. Lichtman, Universidad de Harvard, EE. UU.

Sección ultrafina de cerebro de ratón. Muestra: Cortesía de J. Lichtman, Universidad de Harvard, EE. UU.

Gracias a las herramientas informáticas de Atlas 5 Array Tomography, podrá definir un número ilimitado de regiones de interés con cualquier forma en cientos de secciones en serie. Esto resulta especialmente útil en experimentos como capturar el cerebro de mono o las conexiones neuronales en el cerebro de ratón.

Sección ultrafina de cerebro de ratón

Sección ultrafina de cerebro de ratón

Sección ultrafina de cerebro de ratón

Sección ultrafina de cerebro de ratón. Muestra: Cortesía de J. Lichtman, Universidad de Harvard, EE. UU.

Sección ultrafina de cerebro de ratón. Muestra: Cortesía de J. Lichtman, Universidad de Harvard, EE. UU.

Esta imagen es una imagen SEM a gran escala de una sección ultrafina de un cerebro de ratón montado sobre un sustrato. Se adquirió utilizando Atlas 5 Array Tomography para ayudar a automatizar la adquisición.

Se pueden identificar detalles subcelulares como el núcleo y las mitocondrias y, cuando se reconstruyen en 3D, las conexiones entre las distintas neuronas se pueden cartografiar.

Sección ultrafina de cerebro de ratón

Sección ultrafina de cerebro de ratón

Sección ultrafina de cerebro de ratón

Sección ultrafina de cerebro de ratón. Muestra: Cortesía de J. Lichtman, Universidad de Harvard, EE. UU.

Sección ultrafina de cerebro de ratón. Muestra: Cortesía de J. Lichtman, Universidad de Harvard, EE. UU.

Esta imagen muestra varios cortes de cerebro montados en cinta, listos para la captura de imágenes. Atlas 5 Array Tomography identifica cada una de las secciones del cerebelo para su posterior adquisición con SEM de alta resolución y toda la información útil sobre cada corte está recogida en la plataforma del programa.

Sección ultrafina de cerebro de ratón. Muestra: Cortesía de J. Lichtman, Universidad de Harvard, EE. UU.

Este vídeo demuestra el gran valor de utilizar Atlas 5 Array Tomography para agilizar sus flujos de trabajo de AT. A medida que avanza el vídeo, podrá ver cómo los datos de alta resolución capturados de cada corte pueden combinarse para generar en última instancia un conjunto de datos en 3D.

Sección ultrafina de cerebro de ratón

Sección ultrafina de cerebro de ratón

Sección ultrafina de cerebro de ratón
Sección ultrafina de cerebro de ratón. Muestra: Cortesía de J. Lichtman, Universidad de Harvard, EE. UU.
Sección ultrafina de cerebro de ratón. Muestra: Cortesía de J. Lichtman, Universidad de Harvard, EE. UU.

Para captar el nervio óptico con SEM de alta resolución, es necesario capturar imágenes de secciones individuales y luego reconstruirlas. Con Array Tomography, estas secciones pueden localizarse automáticamente y, posteriormente, capturarse en imágenes para garantizar que el proceso de adquisición sea rápido y sencillo. 

Sección ultrafina de cerebro de ratón

Sección ultrafina de cerebro de ratón

Sección ultrafina de cerebro de ratón
Sección ultrafina de cerebro de ratón. Muestra: Cortesía de J. Lichtman, Universidad de Harvard, EE. UU.
Sección ultrafina de cerebro de ratón. Muestra: Cortesía de J. Lichtman, Universidad de Harvard, EE. UU.

La imagen muestra las secciones individuales del nervio óptico, montadas en una lámina y a la espera de la captura de imágenes mediante el software Atlas 5.

Imágenes captadas del nervio óptico de ratón mediante tomografía de matriz. Muestra: Cortesía de J. Lichtman, Universidad de Harvard, EE. UU.

Cuando se capturan imágenes del cerebro con Array Tomography, existen cientos o miles de cortes que es necesario localizar y visualizar. La identificación manual de cada uno de estos cortes es laboriosa y requiere mucho tiempo. Atlas 5 identifica automática y rápidamente cada una de las secciones, de forma que la captura de imágenes posterior puede comenzar de manera rápida y eficaz, y toda la información de alta resolución sobre cada corte queda registrado en el programa.

Comprender el impacto de las bacterias en nódulos radiculares en la salud y el estado de las plantas

Visualizar la distribución de los nódulos radiculares y las bacterias mediante la superposición de datos de fluorescencia y estructurales utilizando Correlative Array Tomography (CAT).

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos. Cortesía de D. Sherrier, J. Caplan y S. Modla, Universidad de Delaware, EE. UU.

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos. Cortesía de D. Sherrier, J. Caplan y S. Modla, Universidad de Delaware, EE. UU.

La red radicular de una planta proporciona acceso al agua y a los nutrientes, que son componentes cruciales para el crecimiento de cualquier planta. Explorar toda la red radicular, así como comprender la influencia de los microbios externos, es importante para mejorar la salud y el rendimiento de las plantas.

Para investigar la relación simbiótica entre las plantas y las bacterias en los nódulos radiculares es necesario conocer la distribución de los nódulos radiculares y de las bacterias, y para comprenderla en detalle es fundamental combinar tanto la fluorescencia como la evaluación estructural de alta resolución.

La tomografía de matriz correlativa permite la superposición de datos de fluorescencia y estructurales para poder visualizar la distribución de los nódulos radiculares y las bacterias.

La combinación de información estructural de alta resolución y de fluorescencia precisa es fundamental para comprender en profundidad cómo influyen las bacterias de los nódulos radiculares en el estado de las plantas.

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos. Cortesía de D. Sherrier, J. Caplan y S. Modla, Universidad de Delaware, EE. UU.

Las imágenes son reconstrucciones en 3D o cortes individuales de datos de fluorescencia de secciones en serie de nódulos radiculares que muestran la distribución de los plasmodesmos. Se puede superponer la pila con los datos de SEM para investigar la relación de la infección bacteriana y la distribución de los plasmodesmos.

La muestra se incluyó en resina Epon y se cortó con un ultramicrótomo. Las secciones en serie se transfirieron a cubreobjetos recubiertos de ITO mediante un micromanipulador. Se realizó una tinción de las paredes celulares con calcoflúor blanco (azul) y, frente a la callosa, se realizó una tinción de los plasmodesmos con Alexa Fluor 647. La muestra se tiñó posteriormente para capturar imágenes en el SEM.

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos
Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos
Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos
Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos
Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos
Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Nódulos radiculares que muestran la distribución de plasmodesmos

Cómo configurar una adquisición de Array Tomography

Este vídeo ilustra el flujo de trabajo utilizado por ZEISS Atlas 5 Array Tomography para generar un conjunto de datos correlativos con datos de fluorescencia y SEM. Uno de los ejemplos que aparecen en el vídeo es el de una muestra de levadura para demostrar cómo se puede configurar.

La muestra de levadura que aparece en el vídeo se incluyó en resina Epon y se cortó con un ultramicrótomo. Las secciones en serie se transfirieron a cubreobjetos recubiertos de ITO mediante un micromanipulador. Primero se captaron imágenes de la muestra con el microscopio óptico y posteriormente se tiñó para capturar imágenes en el SEM.

Cortesía de D. Sherrier, J. Caplan y S. Modla, Universidad de Delaware, EE. UU.
 

Comprender la biología y la progresión de la corea de Huntington

Visualizar el desarrollo de placas proteicas en macrófagos utilizando Correlative Array Tomography (CAT).

Macrófagos que muestran placas proteicas inducidas por la agregación de la proteína huntingtina mutante

Macrófagos que muestran placas proteicas inducidas por la agregación de la proteína huntingtina mutante

Macrófagos que muestran placas proteicas inducidas por la agregación de la proteína huntingtina mutante

Macrófagos que muestran placas proteicas inducidas por la agregación de la proteína huntingtina mutante. La imagen es un conjunto de datos de fluorescencia tomados de una sección y muestra placas proteicas en los macrófagos. ADN: azul (DAPI); proteína huntingtina: rojo (Alexa Fluor 647). Cortesía de Jeff Caplan, Universidad de Delaware, EE. UU.

Macrófagos que muestran placas proteicas inducidas por la agregación de la proteína huntingtina mutante. La imagen es un conjunto de datos de fluorescencia tomados de una sección y muestra placas proteicas en los macrófagos. ADN: azul (DAPI); proteína huntingtina: rojo (Alexa Fluor 647). Cortesía de Jeff Caplan, Universidad de Delaware, EE. UU.

La corea de Huntington es una enfermedad neurodegenerativa incurable y progresiva causada por un gen defectuoso en el cromosoma 4 que codifica la proteína huntingtina. El gen defectuoso provoca la formación de la proteína huntingtina mutante que se pliega de forma incorrecta y se agrupa provocando el desarrollo de placas proteicas en el cerebro. Un deterioro de este tipo en el cerebro provoca trastornos en el movimiento, el comportamiento, el pensamiento y las emociones.
 

La sobreexpresión de la huntingtina provoca una agregación de la proteína claramente visible dentro de la pila Z

La sobreexpresión de la huntingtina provoca una agregación de la proteína claramente visible dentro de la pila Z

La sobreexpresión de la huntingtina provoca una agregación de la proteína claramente visible dentro de la pila Z

Una sobreexpresión de huntingtina da lugar a una agregación de la proteína claramente visible dentro de la pila Z. Se utilizó un anticuerpo frente a GFP-Huntington para localizar placas de huntingtina dentro de las células (Alexa Fluor 647, rojo). El núcleo se muestra en azul (Hoechst). La correlación de la pila z del microscopio óptico con la pila Z del microscopio electrónico de barrido muestra la distribución de las placas de huntingtina y la localización del núcleo en 3D. Cortesía de J. Caplan, E. Kmiec y S. Modla, Universidad de Delaware, EE. UU.

Una sobreexpresión de huntingtina da lugar a una agregación de la proteína claramente visible dentro de la pila Z. Se utilizó un anticuerpo frente a GFP-Huntington para localizar placas de huntingtina dentro de las células (Alexa Fluor 647, rojo). El núcleo se muestra en azul (Hoechst). La correlación de la pila z del microscopio óptico con la pila Z del microscopio electrónico de barrido muestra la distribución de las placas de huntingtina y la localización del núcleo en 3D. Cortesía de J. Caplan, E. Kmiec y S. Modla, Universidad de Delaware, EE. UU.

Visualizar el desarrollo de las placas proteicas en los macrófagos, que se utilizan como sistema modelo para la investigación de esta enfermedad, y comprender cómo se relacionan con los detalles celulares ultraestructurales es importante para entender la biología y la progresión de la corea de Huntington.

Correlative Array Tomography ofrece la oportunidad de explorar la información ultraestructural y los datos de fluorescencia de secciones en serie de este macrófago.

La correlación de la pila Z del microscopio óptico con la pila Z del microscopio electrónico de barrido muestra la distribución de las placas de huntingtina y la localización del núcleo en 3D

La correlación de la pila Z del microscopio óptico con la pila Z del microscopio electrónico de barrido muestra la distribución de las placas de huntingtina y la localización del núcleo en 3D

La correlación de la pila Z del microscopio óptico con la pila Z del microscopio electrónico de barrido muestra la distribución de las placas de huntingtina y la localización del núcleo en 3D

La correlación de la pila z del microscopio óptico con la pila Z del microscopio electrónico de barrido muestra la distribución de las placas de huntingtina y la localización del núcleo en 3D. Cortesía de J. Caplan, E. Kmiec y S. Modla, Universidad de Delaware, EE. UU.

La correlación de la pila z del microscopio óptico con la pila Z del microscopio electrónico de barrido muestra la distribución de las placas de huntingtina y la localización del núcleo en 3D. Cortesía de J. Caplan, E. Kmiec y S. Modla, Universidad de Delaware, EE. UU.

La correlación entre la información ultraestructural de alta resolución y los datos de fluorescencia es importante para comprender en profundidad la biología y la progresión de la corea de Huntington.

La imagen de la izquierda/arriba muestra una representación esquemática de la información obtenida en 3D mediante la combinación de las imágenes en serie del microscopio óptico y el SEM de macrófagos que expresan la proteína huntingtina resultantes de un experimento de ZEISS ZEN Correlative Array Tomography.

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