蔡司冷冻关联工作流程
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蔡司冷冻关联工作流程

冷冻条件下的TEM薄片制备和体积成像

蔡司冷冻关联工作流程通过简单易用的无缝工作流程,将宽场、激光共聚焦和聚焦离子束扫描电子显微镜相关联。这一解决方案针对冷冻关联工作流程的需求对软硬件进行了优化,涵盖从荧光大分子的定位到高衬度体积成像以及冷冻透射电子断层扫描的薄片样品制备等多个方面。

  • 多模式间无缝衔接的冷冻关联工作流程
  • 高分辨率荧光成像
  • 高衬度冷冻三维结构成像和三维重构
  • 用于冷冻TEM应用的靶向网格薄片减薄
  • 用于满足冷冻和室温情况下的多种需求

接近原生状态的成像

蔡司冷冻关联工作流程可让您在冷冻条件下掌握具有挑战性的不同成像模式组合。

精简的工作流程,帮助您专注于研究

蔡司冷冻关联工作流程可让您在冷冻条件下掌握具有挑战性的不同成像模式组合。这一工作流程解决方案将光学和电子显微镜连接起来,实现了冷冻体积成像和冷冻TEM薄片的高效制备。专用配件精简了工作流程,方便冷冻样品在显微镜之间的安全转移。ZEN Connect可保障数据管理,让您对整个工作流程的数据都了如指掌。一系列处理工具帮助您增强成像结果。

双重标记酵母细胞(CNM67-tdTomato和NUP-GFP)。LSM图像(左)和Crossbeam图像(右)。
双重标记酵母细胞(CNM67-tdTomato和NUP-GFP)。LSM图像(左)和Crossbeam图像(右)。 样品由瑞士苏黎世联邦理工学院的M. Pilhofer提供
样品由瑞士苏黎世联邦理工学院的M. Pilhofer提供

双重标记酵母细胞(CNM67-tdTomato和NUP-GFP)。LSM图像(左)和Crossbeam图像(右)。

出色的部件为您提供高质量的数据

借助兼容低温的冷冻物镜和Airyscan探测器的高灵敏度,蔡司LSM系统让您能够以高分辨率检测蛋白质和细胞结构,同时低光毒性的照明和恒定低温系统可防止您的样品产生去玻璃化效应。蔡司Crossbeam FIB-SEM可以让您享受高衬度的体积成像,甚至无需对您的样品进行重金属染色。这两种模式都提供了宝贵的功能和结构信息,无论您是否跟进后续的TEM研究,都可以对超微结构有全面的了解。

图片说明: 双重标记酵母细胞(CNM67-tdTomato和NUP-GFP)。LSM图像(左)和Crossbeam图像(右)。样品由瑞士苏黎世联邦理工学院的M. Pilhofer提供

配备冷冻设备的分析测试平台

多用途解决方案,保证您成像设备的效率

与其他解决方案不同,工作流程中所涉及的蔡司显微镜不仅可以用于冷冻电镜,还可以用于室温应用,这在显微镜并非完全只用于冷冻实验时尤为有利。用户无需专业技术知识,即可快速将设备从冷冻切换到室温使用。该灵活性让您有更多的时间进行实验,而成像设备让您拥有更高的利用率和更快的投资回报。

蔡司冷冻关联工作流程概览

冷冻关联工作流程
冷冻关联工作流程

优势

  • 带玻璃化样品的HPF样品载体
  • 带玻璃化样品的TEM铜网
  • 带玻璃化样品的HPF样品载体(点击图片查看更多细节);图像提供者:荷兰拉德堡德大学医学中心的Anat Akiva和Nico Sommerdijk

    带玻璃化样品的HPF样品载体

    带玻璃化样品的HPF样品载体。左图示例显示了冰污染和脱玻璃化作用,并取消了对其进行进一步的电镜成像。右图示例显示了冰污染的区域以及玻化度高的区域(半透明区域)。

    在光学显微镜下使用不同的观察 方式(荧光、反射光)来检查样品的冰损伤。

    左图示例显示了冰污染和脱玻璃化作用,并取消了对其进行进一步的电镜成像。右图示例显示了冰污染的区域以及玻化度高的区域(半透明区域)。

    带玻璃化样品的HPF样品载体(点击图片查看更多细节);图像提供者:荷兰拉德堡德大学医学中心的Anat Akiva和Nico Sommerdijk

  • 带玻璃化样品的TEM铜网

    带玻璃化样品的TEM铜网

    带玻璃化样品的TEM铜网

    左图显示了铜网顶部的冰晶。右图的TEM铜网上看不到冰污染。

    带玻璃化样品的TEM铜网(点击图片查看更多细节)

评估样品质量,防止样品损坏

冷冻电镜的常见问题有样品损耗、冰污染和脱玻璃化作用。蔡司冷冻关联工作流程的设计旨在保护您珍贵的玻璃化样品,避免在工作流程中可能出现的众多隐患。

蔡司冷冻配件包与蔡司LSM/Airyscan和蔡司Crossbeam的成像功能搭配,可减轻在冷冻条件下工作时损耗或破坏您样品的风险。

在工作流程中管理您的样品之前,玻璃化本身即是一项挑战。尽管玻璃化技术近年来有所发展,但样品仍然经常覆盖在厚冰层下,或只是部分玻璃化,并显示出无定形的冰区域。玻璃化不佳会破坏细胞和组织的超微结构。除非您的光学显微镜或FIB-SEM早在工作流程初期便提供了样品评价的方法,否则只能在TEM中识别这些区域。

蔡司LSM使用不同的观察方式来提供这一评估能力。蔡司Crossbeam出色的衬度性能还可以对样品质量进行可靠评估。这将为您节省时间,并提高实验效率。

  • 快速冷冻的Hela细胞(Histone 2-GFP标记),显示了进一步成像的理想条件。冰层厚约6.8 µm,覆盖了玻璃化的细胞。这些细胞非常适合进一步的FIB-SEM分析。

冰厚度测量和有效的感兴趣区域定位

冰厚度测量对于判断样品质量和定位玻璃化样品中感兴趣的细胞至关重要。使用光学显微镜可以轻松验证您的样品。反射光和共聚焦荧光成像为您提供关于质量的一手信息,让您清晰定位有研究价值潜力的细胞。

如果荧光信号呈模糊蛛网状图形,通常表明冷冻效果差。此外,快速冷冻样品会在一个样品中展现出不同的冷冻质量和保存状态。在进入下一个冷冻关联工作流程阶段之前,关于冰厚度和质量的信息可以节省预选细胞的时间。

解决方案概览

蔡司冷冻配件工具包

蔡司冷冻配件工具包

蔡司冷冻配件工具包

蔡司冷冻配件工具包

蔡司冷冻配件工具包

蔡司冷冻关联工作流程可以使用各种样品载具。无论您是使用TEM铜网、AutoGrid、蓝宝石盘还是HPF板,都可以借助冷冻配件工具包轻松装载、转移和存储样品。一系列的配件和工具可保证在整个工作流程中能够安全处理样品。组件与以下设备兼容:

  • Linkam CMS196V³冷冻关联显微镜载物台
  • Quorum PP3010Z冷冻系统
蔡司Crossbeam:可旋转冷冻镜台下部

蔡司Crossbeam:可旋转冷冻镜台下部

蔡司Crossbeam:可旋转冷冻镜台下部

蔡司Crossbeam:可旋转冷冻镜台下部

蔡司Crossbeam安全易操作的样品转移和处理

蔡司冷冻关联工作流程配有Quorum PP3010Z,一个高度自动化、简单易用的气冷式冷冻制备系统。

  • 冷冻制备室使用了涡轮分子泵,包括可控自动升华和喷镀的工具。
  • 玻璃化样品从冷冻制备室直接连接到蔡司Crossbeam样品仓,在一个高度稳定的冷载物台上进行成像和切割。
  • 冷冻制备室和Crossbeam样品仓中的冷阱可以保护样品免受冰污染。
  • CHE3010柱外冷却系统确保了至少24小时的连续冷却
  • 所有Quorum冷冻组件均由Prepdek®工作站控制,该工作站包含了用于冷冻转移设备的真空存储管以及用于蔡司装载站的TEM prep slusher。

可靠的成像方式组合

  • 冷冻宽场和共聚焦显微镜与冷冻SEM体积成像和TEM薄片制备组合

冷冻宽场和共聚焦显微镜

蔡司Axio Imager是蔡司冷冻关联工作流程的理想光学显微镜选择,可配备Linkam的冷冻载物台CMS196V3。根据要求,您可以将Axio Imager配置为宽场系统(使用Apotome 3获取三维数据集)和采用Airyscan 2技术的LSM 900/980进行高分辨率共聚焦成像。

LSM和宽场显微镜都是多功能工具,可以在不影响图像质量的情况下,快速从冷冻转换到室温实验,反之亦然。

冷冻SEM体积成像和TEM薄片制备

蔡司Crossbeam的设计旨在为您提供高易用性和出色的图像衬度。即使是未染色的玻璃化样品,该FIB-SEM也能在低温下生成高衬度图像,让您可以对细胞和组织的超微结构进行研究,并使细胞腔隙清晰可见。蔡司Crossbeam也可实时观察成像和切割过程——您可以精准控制切割过程,并确保有针对性地对超薄TEM薄片进行减薄。

蔡司Crossbeam可在不影响性能的情况下作为多功能工具使用。

蔡司ZEN Connect中的冷冻关联数据集

蔡司ZEN Connect中的冷冻关联数据集

蔡司ZEN Connect中的冷冻关联数据集

蔡司ZEN Connect中的冷冻关联数据集

一站式应用:配置完备的软件包

为了确保冷冻关联工作流程的简洁高效以及各种组件的无缝配合,我们扩展了相关软件平台,添加了冷冻特定功能。为应对关联冷冻电镜带来的挑战,我们还开发了额外的软件模块。

  • ZEN
  • ZEN Connect Toolkit
  • ZEN EM处理工具箱
  • SmartSEM和SmartFIB
  • 冷冻漂移矫正

应用

蔡司冷冻关联工作流程的应用案例

  • 光镜和电镜数据集——从铜网预览到用于进一步TEM断层扫描识别的感兴趣区域
  • 制备好的薄片的FIB图像;薄片厚度:230 nm
  • 分割和重构的断层扫描图像
  • 光镜和电镜数据集——从铜网预览到用于进一步TEM断层扫描识别的感兴趣区域
  • 制备好的薄片的FIB图像;薄片厚度:230 nm
    制备好的薄片的FIB图像;薄片厚度:230 nm

    制备好的薄片的FIB图像;薄片厚度:230 nm

    制备好的薄片的FIB图像;薄片厚度:230 nm

  • 分割和重构的断层扫描图像

细胞生物学

辨识罕见事件

在酵母细胞内定位纺锤极体这种又小又罕见的结构十分困难。而蔡司冷冻关联工作流程可以让您在接近原生状态的情况下对这种细胞结构进行准确的识别和成像。配备Airyscan探测器的LSM使得这些结构更容易辨识,因此可以对更多细节进行成像。所有图像(从整个细胞的大范围概览到这些微小结构的高分辨率图像)都可整理在一个ZEN Connect项目中,为后续在FIB-SEM中重新定位这些细胞结构提供所需的所有数据。

使用Crossbeam可以为Cryo-ET制备已识别区域的TEM薄片,也可进行体积成像。此外,蔡司冷冻关联工作流程解决方案可让您在图像采集后重新连接所有数据。Crossbeam的图像或TEM的断层扫描成像可与LSM数据相结合,并进行三维渲染。

NUP(核孔复合物)-GFP和CNM67-tdTomato标记的酵母细胞。
样品和断层扫描图像由瑞士苏黎世联邦理工学院的M. Pilhofer提供

  • 高分辨率LSM/Airyscan图像与低温环境下采集到的高衬度Crossbeam图像的叠加。叠加通过ZEN Connect完成。
  • 酵母细胞的三维重构以及对细胞核(深蓝色)和几个线粒体的分割。
  • 高分辨率LSM/Airyscan图像与低温环境下采集到的高衬度Crossbeam图像的叠加。叠加通过ZEN Connect完成。
  • 酵母细胞的三维重构以及对细胞核(深蓝色)和几个线粒体的分割。

细胞生物学

关联三维体积成像

一旦在LSM系统中识别出细胞结构(如纺锤极体),蔡司Crossbeam出色的成像质量便可让您使用冷冻体积成像对超微结构进行定位和分析。即便是使用低加速电压,Crossbeam也能在保护样品不受损伤的同时对未染色的玻璃化样品进行高衬度成像。LSM采集到的高分辨率图像和Crossbeam的高衬度图像方便您进行精准的图像叠加。使用ZEN Connect在Crossbeam中重新定位感兴趣区域,便可采集到已识别细胞的三维数据集。在关联三维结构中,两个纺锤极体得到定位。根据FIB的切割方向,单个微管的取向在高衬度图像中变得清晰可见。更多的细胞腔室可以在三维结构中得以识别。

样品由瑞士苏黎世联邦理工学院的M. Pilhofer提供

纵向切开的核膜内的纺锤极体(上图)和横向切开的核膜外的微管(下图)。获取序列图像的图像步长:50 nm
纵向切开的核膜内的纺锤极体(上图)和横向切开的核膜外的微管(下图)。获取序列图像的图像步长:50 nm

纵向切开的核膜内的纺锤极体(上图)和横向切开的核膜外的微管(下图)。获取序列图像的图像步长:50 nm

纵向切开的核膜内的纺锤极体(上图)和横向切开的核膜外的微管(下图)。获取序列图像的图像步长:50 nm

  • 蓝宝石盘上生长的快速冷冻腺癌细胞。
  • 显示出强烈线粒体裂变图样的腺癌细胞三维数据集。
  • 在Crossbeam数据集一个子集中自动分割的线粒体网络。
  • 蓝宝石盘上生长的快速冷冻腺癌细胞。
    蓝宝石盘上生长的快速冷冻腺癌细胞。

    蓝宝石盘上生长的快速冷冻腺癌细胞。

    蓝宝石盘上生长的快速冷冻腺癌细胞。

  • 显示出强烈线粒体裂变图样的腺癌细胞三维数据集。
    显示出强烈线粒体裂变图样的腺癌细胞三维数据集。

    显示出强烈线粒体裂变图样的腺癌细胞三维数据集。

    显示出强烈线粒体裂变图样的腺癌细胞三维数据集。

  • 在Crossbeam数据集一个子集中自动分割的线粒体网络。

癌症研究

癌细胞呈现强烈的线粒体裂变表型,这可能是其产生抗药性的原因。化学固定方法经常会造成线粒体堆积等伪影,而这些伪影可能被误认为裂变事件。冷冻固定则可以避免这些伪影,并将样品保持在接近原生状态。

示例显示了蓝宝石盘上快速冷冻的腺癌细胞。LSM数据突出显示了一个裂变增加的密集型线粒体网络,该裂变随后由Crossbeam数据证实。LSM和Airyscan成像后,玻璃化样品被转移到Crossbeam中。ZEN Connect用于重新定位感兴趣区域,在采集后叠加各自的数据集,并管理所有采集到的图像。

  • LSM用样品的自发荧光来识别气孔和内化色素体。用Crossbeam对选定的气孔重定位并成像。
  • 在使用Crossbeam采集到的剖面中,基质清晰可见。
  • FIB序列图像的三维重构和分割显示了色素体的形态。重构展示了基质与线粒体的密切互动。
  • LSM用样品的自发荧光来识别气孔和内化色素体。用Crossbeam对选定的气孔重定位并成像。
    LSM用样品的自发荧光来识别气孔和内化色素体。用Crossbeam对选定的气孔重定位并成像。

    LSM用样品的自发荧光来识别气孔和内化色素体。用Crossbeam对选定的气孔重定位并成像。

    LSM用样品的自发荧光来识别气孔和内化色素体。用Crossbeam对选定的气孔重定位并成像。

  • 在使用Crossbeam采集到的剖面中,基质清晰可见。
    在使用Crossbeam采集到的剖面中,基质清晰可见。

    在使用Crossbeam采集到的剖面中,基质清晰可见。

    在使用Crossbeam采集到的剖面中,基质清晰可见。

  • FIB序列图像的三维重构和分割显示了色素体的形态。重构展示了基质与线粒体的密切互动。

植物科学

植物对变化的环境条件(如盐度增加)所作出的反应是植物科学中一个重要的研究课题。在应对这些变化条件时,植物通常会表现出应激反应。在超微结构层面能够观察到的一个效应是基质(Stromule)的形成,基质是色素体中的长管状延伸。

ZEN Connect展示了不同成像模式的图像:LSM使用样品的自发荧光来定位气孔和内化色素体。成功重定位感兴趣区域后,LSM图像与所选气孔的SEM预览图相叠加。气孔的FIB序列图像得到采集。电镜数据集显示了色素体中基质形成的增长。

样品提供者:德国霍恩海姆大学的B. Franzisky

  • 上:在冷冻替代前,使用LSM / Airyscan系统在冷冻温度下对线虫进行了成像。下:使用Crossbeam对包埋和染色的线虫进行了成像。
  • 细胞结构的重构,如自噬体(AP)或不同有丝分裂阶段的基因组(*细胞在中期,#细胞在末期)。
  • 细胞结构的三维重构
  • 上:在冷冻替代前,使用LSM / Airyscan系统在冷冻温度下对线虫进行了成像。下:使用Crossbeam对包埋和染色的线虫进行了成像。
    上:在冷冻替代前,使用LSM / Airyscan系统在冷冻温度下对线虫进行了成像。下:使用Crossbeam对包埋和染色的线虫进行了成像。

    上:在冷冻替代前,使用LSM / Airyscan系统在冷冻温度下对线虫进行了成像。下:使用Crossbeam对包埋和染色的线虫进行了成像。

    上:在冷冻替代前,使用LSM / Airyscan系统在冷冻温度下对线虫进行了成像。下:使用Crossbeam对包埋和染色的线虫进行了成像。

  • 细胞结构的重构,如自噬体(AP)或不同有丝分裂阶段的基因组(*细胞在中期,#细胞在末期)。
    细胞结构的重构,如自噬体(AP)或不同有丝分裂阶段的基因组(*细胞在中期,#细胞在末期)。

    细胞结构的重构,如自噬体(AP)或不同有丝分裂阶段的基因组(*细胞在中期,#细胞在末期)。

    细胞结构的重构,如自噬体(AP)或不同有丝分裂阶段的基因组(*细胞在中期,#细胞在末期)。

  • 细胞结构的三维重构

发育生物学

秀丽隐杆线虫中有丝分裂细胞的研究

整个秀丽隐杆线虫由HPF固定,处于中期的胚胎细胞通过低温荧光显微镜进行原位成像。然后通过冷冻替代对筛选出的线虫进行重金属染色、树脂包埋和切片,因此可以使用Crossbeam对相同的三维结构进行高分辨率、高衬度的定位和成像。使用这一工作流程可以成功重构线虫处于中期的胚胎细胞。此外,该方法可给您带来意外收获:一个相邻的有趣的点状荧光信号能够与一个假定的自噬体相关联。

因此,低温荧光显微镜能够对高压冷冻厚样品接近原生状态的瞬时细胞结构进行捕捉和成像;通过合适的处理并关联三维结构电镜成像,可以对这些目标结构进行高分辨率的三维重构。

由美国国家癌症研究所/ NIH和弗雷德里克国家癌症研究实验室的K. Narayan提供

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    • 蔡司冷冻光电关联解决方案

      冷冻透射薄片样品制备和冷冻体积成像解决方案

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