ZEISS Correlative Cryo Workflow
製品

ZEISS Correlative Cryo Workflow

クライオ条件下でのTEMラメラ作製およびボリュームイメージング

ZEISS Correlative Cryo Workflowは、ワイドフィールド顕微鏡、レーザー走査型顕微鏡、集束イオンビーム走査電子顕微鏡をシームレスに組み合わせ、使いやすい手順を構築しました。このソリューションは、蛍光高分子の位置確認から高コントラストボリュームイメージングおよびクリオ電子線トモグラフィーを目的としたオングリッドラメラ薄片作製まで、相関クライオ顕微鏡ワークフローのニーズに最適化したハードウェアとソフトウェアを提供します。

  • マルチモーダルなイメージング手法を統合したシームレスなクライオワークフロー
  • 高分解能蛍光イメージング
  • 高コントラストボリュームイメージングと3D再構成
  • クライオTEMアプリケーション向けオングリッドラメラ薄片作成
  • 極低温から室温までのアプリケーションに幅広く対応

生理的環境に近い状態をイメージング

ZEISS Correlative Cryo Workflowでは、クライオ条件下で様々なイメージング手法の組み合わせを簡単に使用できます。

シンプルなワークフローで研究に集中

ZEISS Correlative Cryo Workflowでは、クライオ条件下で様々なイメージング手法の組み合わせを簡単に使用できます。このワークフローソリューションは、光学顕微鏡法と電子顕微鏡法を組み合わせ、ボリュームイメージングおよび効率的なTEMラメラ作製を可能にします。専用アクセサリがワークフローを簡素化し、顕微鏡間で低温試料を安全かつ簡単に搬送できます。ZEN Connectによって、全ワークフローのデータ管理が保証され、データがコンテキスト内に保存されます。さらに、一連の処理ツールを使用することで、イメージング結果の処理を行うことができます。

二重標識された酵母細胞(CNM67-tdTomatoおよびNUP-GFP)。LSM画像(左)とCrossbeam画像(右)。
二重標識された酵母細胞(CNM67-tdTomatoおよびNUP-GFP)。LSM画像(左)とCrossbeam画像(右)。 試料ご提供:M. Pilhofer, ETH Zürich, Switzerland
試料ご提供:M. Pilhofer, ETH Zürich, Switzerland

二重標識された酵母細胞(CNM67-tdTomatoおよびNUP-GFP)。LSM画像(左)とCrossbeam画像(右)。

最高レベルのデータ品質を提供する優れたコンポーネント

クライオに適合した対物レンズと高感度なAiryscan検出器を搭載したZEISS LSMシステムは、低ダメージの照射と一定の低温で試料の失透を防ぎながら、タンパク質や細胞構造を高分解能で検出することができます。さらに、ZEISS Crossbeam集束イオンビームSEMは、試料の重金属染色を必要とせず、高コントラストなボリュームイメージングを実現します。この2つのモダリティにより、その後TEM研究を行うかどうかに関わらず、細胞の超微細構造の包括的理解を可能にする有益な機能情報と構造的情報を得ることができます。

キャプション: 二重標識された酵母細胞(CNM67-tdTomatoおよびNUP-GFP)。LSM画像(左)とCrossbeam画像(右)。試料ご提供:M. Pilhofer, ETH Zürich, Switzerland

低温機器のあるコアイメージング施設

イメージング施設の生産性を維持する多目的ソリューション

本ワークフローで使用されるZEISS顕微鏡は、他のソリューションと異なり、クライオ顕微鏡法のみならず、室温にも応用できます。これは、顕微鏡が超低温実験で十分に活用されていない場合に特に有益となります。装置の超低温から室温使用への切り替えは簡単で、専門知識は必要ありません。この使用温度の柔軟さによって、実験により多くの時間を費やすことができます。さらに、使いやすいだけでなく、投資額をすぐに回収できるため、イメージング施設に多くのメリットをもたらします。

ZEISS Correlative Cryo Workflowの概要

Correlative Cryo Workflow
Correlative Cryo Workflow

特長

  • HPF(高圧凍結装置)キャリア上のガラス化試料
  • TEMグリッド上のガラス化試料
  • HPF(高圧凍結装置)キャリア上のガラス化試料(詳細はクリック)。画像ご提供:Anat Akiva & Nico Sommerdijk, Radboud University Medical Center, The Netherlands

    HPF(高圧凍結装置)キャリア上のガラス化試料

    HPF(高圧凍結装置)キャリア上のガラス化試料左の例は、アイスコンタミネーションと失透を示しています。その後、EMイメージングを実施して解消されました。右の例では、アイスコンタミネーション領域と良好にガラス化された領域(半透明の部分)が混在しています。

    試料は、光学顕微鏡で複数のコントラスト法(蛍光、反射光)を使用して、アイスダメージの有無を検査しました。

    左の例は、アイスコンタミネーションと失透を示しています。その後、EMイメージングを実施して解消されました。右の例では、アイスコンタミネーション領域と良好にガラス化された領域(半透明の部分)が混在しています。

    HPF(高圧凍結装置)キャリア上のガラス化試料(詳細はクリック)。画像ご提供:Anat Akiva & Nico Sommerdijk, Radboud University Medical Center, The Netherlands

  • TEMグリッド上のガラス化試料

    TEMグリッド上のガラス化試料

    TEMグリッド上のガラス化試料

    左の画像は、グリッド上部の氷晶です。右側のTEMグリッドには、アイスコンタミネーションは認められません。

    TEMグリッド上のガラス化試料(詳細はクリック)

良質な試料の確保と試料ダメージの防止

試料ロス、アイスコンタミネーション、失透は、クライオ顕微鏡法においてよく起きるトラブルです。ZEISS Correlative Cryo Workflowは、複雑な装置において、貴重なガラス化試料を様々な落とし穴から守るために設計されています。

ZEISS Cryo AccessoryキットおよびZEISS LSM/AiryscanとZEISS Crossbeamの優れたイメージング機能は、試料のロスや破損のリスクを軽減します。

また、クライオ顕微鏡における試料の失透は、それ自体が困難な問題です。近年のガラス化技術の進歩にもかかわらず、ガラス化試料の氷層の厚さの制御や不十分なガラス化の抑制は大きな課題です。ガラス化が不完全だと、細胞と組織の超微細構造が破壊されてしまいます。ワークフローの初期段階に光学顕微鏡やFIB-SEMによる評価ステップが無いと、このような不適切な試料にTEM観察で初めて気づくことになります。

ZEISS LSMでは、様々なコントラスト法を用いてクライオ試料内部のガラス化状態が確認できます。さらに、ZEISS Crossbeamの優れたコントラスト性能によって、クライオ試料の品質評価が可能になります。これにより時間を節約し、実験効率を高めることができます。

  • さらなるイメージングで理想的な状態であることが示されたプランジ凍結HeLa細胞(ヒストン2-GFP標識):蛍光顕微鏡観察により、細胞は厚さ約6.8 μmの氷層で覆われており、FIB-SEM分析に適した状態になっていることがわかる。

氷層の厚さ測定と効率的な関心領域ターゲティング

氷膜厚の厚さ測定は、試料の品質判断やガラス化試料内部の観察対象の位置特定に極めて重要です。光学顕微鏡によって、試料の妥当性を容易に評価することができます。反射光と共焦点蛍光イメージングによって、試料品質に関する最初の情報が得られ、観察対象の位置を明確に確認することが可能です。

蛍光シグナルのクモの巣状のパターンは、凍結不良を簡単に検出できます。さらにプランジ凍結試料は、一個の試料内にも場所によって凍結品質や保存状態が異なります。蛍光顕微鏡データにより氷層の厚さと試料品質に関する情報を得ることで、相関クライオ顕微鏡ワークフローにおいて次のステップに移行する前に、細胞を選択する時間が節約できます。

ソリューションの概要

ZEISS Cryoアクセサリキット

ZEISS Cryoアクセサリキット

ZEISS Cryoアクセサリキット

ZEISS Cryoアクセサリキット

ZEISS Cryoアクセサリキット

ZEISS Correlative Cryo Workflowは、クライオアクセサリキットを用いることで、多様な試料ホルダーを使用できます。TEMグリッド、AutoGrid、サファイヤディスク、HPFプランシェットのいずれを使用しても、クライオアクセサリキットで試料のローディング、搬送と保存を簡単に行えます。豊富なアイテムとツールを備えており、ワークフロー全体を通して試料の安全な取り扱いをサポートします。クライオアクセサリは下記の製品に適用可能です。

  • Linkam CMS196V³クライオ相関顕微鏡ステージ
  • Quorum PP3010Zクライオシステム
ZEISS Crossbeam:回転式低温サブステージ

ZEISS Crossbeam:回転式低温サブステージ

ZEISS Crossbeam:回転式低温サブステージ

ZEISS Crossbeam:回転式低温サブステージ

ZEISS Crossbeamにおける簡単な試料搬送および試料の安全な取り扱い

ZEISS Correlative Cryo Workflowでは、自動化され操作性に優れたガス冷却クライオシステムQuorum PP3010Zを使用します。

  • ターボ分子ポンプつきクライオプレパレーションチャンバーには、自動昇華、スパッタコーティング機能が備わっています。
  • クライオプレパレーションチャンバーはZEISS Crossbeamのチャンバーに直結され、凍結試料は非常に安定した冷却ステージに搬送されて、イメージングとミリング加工が行われます。
  • クライオ調製チャンバーとCrossbeamチャンバー内のコールドトラップにより、試料をアイスコンタミネーションから保護します。
  • CHE3010オフカラム冷却システムによって、24時間以上の連続冷却が保証されます。
  • Prepdek®ワークステーションは、クライオトランスファー用の真空ストレージチューブやZEISSローディングステーション用のTEM prep slusherを含む、全てのQuorumクライオ装置を制御できます。

最高の信頼性を誇るイメージング技術の組み合わせ

  • クライオワイドフィールド共焦点顕微鏡と、クライオSEMボリュームイメージングおよびTEMラメラ作製の組み合わせ

クライオワイドフィールド共焦点顕微鏡

ZEISS Correlative Cryo Workflowに最適な光学顕微鏡ZEISS Axio Imagerには、Linkam製CMS196V3クライオステージを装着できます。要件に応じて、Axio Imagerをワイドフィールドシステム(Apotome 3で3Dデータセットを取得)、LSM 900/980 with Airyscan 2で高分解能共焦点イメージングとして構成可能です。

ZEISSワイドフィールド顕微鏡とLSMシステムはいずれも、画質を損なうことなく低温から室温実験に(およびその逆に)迅速に切り替えできる多目的ツールです。

クライオSEMボリュームイメージングおよびTEMラメラ作製

ZEISS Crossbeamは、最高レベルのユーザビリティとイメージコントラストを実現させます。集束イオンビームSEMは、クライオ条件で非染色のガラス化試料でも高コントラスト観察を可能にし、細胞や組織の超微細構造を可視化することに最適化されています。さらに、ZEISS Crossbeamでは、ミリング加工中のリアルタイムなSEM観察も可能となり、ミリング加工の正確なコントロールや極薄TEMラメラ作製が実現できます。

ZEISS Crossbeamは、高分解能および高コントラストの観察と高精度加工を実現した多用途ツールです。

ZEISS ZEN Connect上の相関クライオデータセット

ZEISS ZEN Connect上の相関クライオデータセット

ZEISS ZEN Connect上の相関クライオデータセット

ZEISS ZEN Connect上の相関クライオデータセット

すべての情報をひとつに:顕微鏡間ワークフローを統合するソフトウェアパッケージ

相関クライオ顕微鏡ワークフローにおける各装置での観察をシームレスに実行するため、ソフトウェアプラットフォームは拡張され、クライオワークフローに特化した機能が導入されています。各種オプションモジュールにより、相関クライオ顕微鏡ワークフローが効率的に行えます。

  • ZEN
  • ZEN Connect Toolkit
  • ZEN EM Processing Toolbox
  • SmartSEMおよびSmartFIB
  • Cryo Drift Reduction

アプリケーション

ZEISS Correlative Cryo Workflowのアプリケーション例

  • LMおよびEMデータセット ― TEMメッシュ全体像からTEMトモグラフィーのための関心領域まで
  • FIBで作製されたTEMラメラ画像、TEMラメラ厚:230 nm
  • セグメンテーションおよび再構成されたトモグラム
  • LMおよびEMデータセット ― TEMメッシュ全体像からTEMトモグラフィーのための関心領域まで
  • FIBで作製されたTEMラメラ画像、TEMラメラ厚:230 nm
    FIBで作製されたTEMラメラ画像、TEMラメラ厚:230 nm

    FIBで作製されたTEMラメラ画像、TEMラメラ厚:230 nm

    FIBで作製されたTEMラメラ画像、TEMラメラ厚:230 nm

  • セグメンテーションおよび再構成されたトモグラム

細胞生物学

細胞内レアイベントの観察

酵母細胞の内部で、紡錘体極小体の位置を特定するのは困難です。それらは小さく、存在することがまれな構造です。ZEISS Correlative Cryo Workflowでは、生理的環境に近い状態で細胞構造を正確に識別およびイメージングできます。Airyscan検出器を搭載したLSMを用いることで、細胞の微細構造まで鮮明に観察できます。また、ZEN Connectプロジェクトにおいて細胞の低倍率全体像から高分解能像までの観察結果が統合され、細胞構造の位置特定に必要な全てのデータは集束イオンビームSEMで再利用できます。

Crossbeamを使用することで、特定した領域のTEMラメラをクライオ電子トモグラフィー用に作製することができます。また、ボリュームイメージングも可能です。さらに、このワークフローソリューションによって、顕微鏡間すべての観察結果を再結合し、再構築できます。Crossbeam画像またはTEMトモグラムは、LSMデータと組み合わせ、3Dコンテキストでのレンダリングが可能です。

NUP(核膜孔複合体)-GFPおよびCNM67-tdTomatoで標識された酵母細胞。
試料・データご提供:M. Pilhofer, ETH Zürich, Switzerland

  • ZEN Connectによるクライオ条件下で取得した高解像度LSM/Airyscan画像と高コントラストCrossbeam画像のオーバーレイ表示。ZEN Connectでオーバーレイを実施。
  • 酵母細胞の3D再構築結果およびセグメンテーションされた核(青色)とミトコンドリア。
  • ZEN Connectによるクライオ条件下で取得した高解像度LSM/Airyscan画像と高コントラストCrossbeam画像のオーバーレイ表示。ZEN Connectでオーバーレイを実施。
  • 酵母細胞の3D再構築結果およびセグメンテーションされた核(青色)とミトコンドリア。

細胞生物学

細胞生物学:相関3Dボリュームイメージング

LSMシステムにおいて紡錘体極体のような細胞構造を識別した後、ZEISS Crossbeamの優れたイメージングによって、狙った細胞の超微細構造のクライオボリュームイメージングが可能になります。Crossbeamの優れた低加速度電圧イメージング性能により、無染色のガラス化試料でも試料損傷を抑制しながら高コントラストのイメージングができます。LSMで取得した高解像度像とCrossbeamによる高コントラスト画像によって、画像のオーバーレイが容易に実現します。ZEN Connectを使用してCrossbeamで関心領域を決めると、識別された細胞の3Dデータが取得されます。2つの紡錘体極体が相関ボリューム内でターゲットになっています。この例では、個々の微小管がFIBの切断方向に沿って高コントラストの画像で明瞭に観察できます。細胞内の他の構造体も3Dイメージングで確認できます。

試料ご提供:M. Pilhofer, ETH Zürich, Switzerland

核膜内の紡錘体極体の縦方向切片(上)と核膜外微小管の横方向切片(下)。取得したスタックの画像ステップサイズ:50 nm
核膜内の紡錘体極体の縦方向切片(上)と核膜外微小管の横方向切片(下)。取得したスタックの画像ステップサイズ:50 nm

核膜内の紡錘体極体の縦方向切片(上)と核膜外微小管の横方向切片(下)。取得したスタックの画像ステップサイズ:50 nm

核膜内の紡錘体極体の縦方向切片(上)と核膜外微小管の横方向切片(下)。取得したスタックの画像ステップサイズ:50 nm

  • サファイヤディスク上にプランジ凍結された腺がん細胞。
  • 腺がん細胞の3Dイメージング。顕著なミトコンドリア核分裂パターンが示されている。
  • Crossbeam 3Dイメージングにおけるミトコンドリアネットワークの自動セグメンテーション結果。
  • サファイヤディスク上にプランジ凍結された腺がん細胞。
    サファイヤディスク上にプランジ凍結された腺がん細胞。

    サファイヤディスク上にプランジ凍結された腺がん細胞。

    サファイヤディスク上にプランジ凍結された腺がん細胞。

  • 腺がん細胞の3Dイメージング。顕著なミトコンドリア核分裂パターンが示されている。
    腺がん細胞の3Dイメージング。顕著なミトコンドリア核分裂パターンが示されている。

    腺がん細胞の3Dイメージング。顕著なミトコンドリア核分裂パターンが示されている。

    腺がん細胞の3Dイメージング。顕著なミトコンドリア核分裂パターンが示されている。

  • Crossbeam 3Dイメージングにおけるミトコンドリアネットワークの自動セグメンテーション結果。

がん研究

がん研究において、ミトコンドリア核分裂の観察により、がん細胞の薬剤抵抗性を評価することが可能性となります。従来の化学固定法はしばしばミトコンドリアの蓄積のようなアーチファクトを生じさせますが、これは核分裂イベントだと誤解釈されることがあります。一方、凍結固定法は化学固定法のアーチファクトを防止し、試料を生理的環境下に近い状態で保存します。

この例は、サファイヤディスク上でプランジ凍結された腺がん細胞です。LSMとCrossbeamいずれのデータからも、密集したミトコンドリアネットワークと核分裂の増大が見られます。Airyscanを搭載した LSMによるイメージングの後、ガラス化試料はCrossbeamに搬送されます。その後ZEN Connectを使用して関心領域の位置特定や各顕微鏡のイメージングデータが重ね合わせられ、取得したすべてのデータが統合されました。

  • LSMで試料の自家蛍光を利用して気孔と内在色素体を識別。Crossbeamで気孔の位置特定およびイメージング。
  • Crossbeamで取得した断面図ではストロミュールが明瞭に観察できる。
  • FIB-SEM 3D再構成とセグメンテーション結果により、色素体の形態が明らかになり、ストロミュールがミトコンドリアと緊密に相互作用していることが分かった。
  • LSMで試料の自家蛍光を利用して気孔と内在色素体を識別。Crossbeamで気孔の位置特定およびイメージング。
    LSMで試料の自家蛍光を利用して気孔と内在色素体を識別。Crossbeamで気孔の位置特定およびイメージング。

    LSMで試料の自家蛍光を利用して気孔と内在色素体を識別。Crossbeamで気孔の位置特定およびイメージング。

    LSMで試料の自家蛍光を利用して気孔と内在色素体を識別。Crossbeamで気孔の位置特定およびイメージング。

  • Crossbeamで取得した断面図ではストロミュールが明瞭に観察できる。
    Crossbeamで取得した断面図ではストロミュールが明瞭に観察できる。

    Crossbeamで取得した断面図ではストロミュールが明瞭に観察できる。

    Crossbeamで取得した断面図ではストロミュールが明瞭に観察できる。

  • FIB-SEM 3D再構成とセグメンテーション結果により、色素体の形態が明らかになり、ストロミュールがミトコンドリアと緊密に相互作用していることが分かった。

植物科学

塩分濃度の上昇などの環境条件の変化に対する植物の反応は、植物科学において重要な研究課題です。一般的に、植物は環境条件変化にストレス反応を示します。これを調べるために、微細構造レベルではストロミュール(色素体から延びる管状の構造)の形成を観察するというような手法があります。

ZEN Connectプロジェクトは、様々なイメージングモダリティの画像を表示しています。まず、試料の自家蛍光を利用して、LSMで気孔と内在色素体の位置を同定しました。その後、FIB-SEMで関心領域の位置を特定し、選択した気孔のSEMオーバービュー画像を用いて、LSM画像をオーバーレイ表示しました。そして、気孔のFIBスタック画像を取得しました。EMデータセットによって、色素体でストロミュールの形成が増大していることが明らかになりました。

試料ご提供:B. Franzisky, University of Hohenheim, Germany

  • 上:線虫。凍結置換前にクライオLSM/Airyscanシステムでイメージング。下:樹脂包埋と染色を施した試料。Crossbeamでイメージング。
  • 異なる分裂期におけるオートファゴソーム(AP)やゲノムなどの細胞構造(*分裂中期の細胞、#分裂終期の細胞)。
  • 細胞構造の3D再構成
  • 上:線虫。凍結置換前にクライオLSM/Airyscanシステムでイメージング。下:樹脂包埋と染色を施した試料。Crossbeamでイメージング。
    上:線虫。凍結置換前にクライオLSM/Airyscanシステムでイメージング。下:樹脂包埋と染色を施した試料。Crossbeamでイメージング。

    上:線虫。凍結置換前にクライオLSM/Airyscanシステムでイメージング。下:樹脂包埋と染色を施した試料。Crossbeamでイメージング。

    上:線虫。凍結置換前にクライオLSM/Airyscanシステムでイメージング。下:樹脂包埋と染色を施した試料。Crossbeamでイメージング。

  • 異なる分裂期におけるオートファゴソーム(AP)やゲノムなどの細胞構造(*分裂中期の細胞、#分裂終期の細胞)。
    異なる分裂期におけるオートファゴソーム(AP)やゲノムなどの細胞構造(*分裂中期の細胞、#分裂終期の細胞)。

    異なる分裂期におけるオートファゴソーム(AP)やゲノムなどの細胞構造(*分裂中期の細胞、#分裂終期の細胞)。

    異なる分裂期におけるオートファゴソーム(AP)やゲノムなどの細胞構造(*分裂中期の細胞、#分裂終期の細胞)。

  • 細胞構造の3D再構成

発生生物学

線虫の有糸分裂細胞の研究

まずクライオ蛍光顕微鏡法により、高圧凍結法で固定された線虫(C. elegans)の体内に存在する分裂中期の胚細胞がイメージングされます。次に、選別された個体に凍結置換で重金属染色を施し、樹脂埋込および切片作成を行います。最後に、Crossbeamにより観察位置を決め、高分解能かつ高コントラストでのイメージングが実行できます。このワークフローを使用して、観察対象の分裂中期を効率よく再構成することができました。このアプローチによる思いがけない発見は、隣接する点状の蛍光シグナルがオートファゴソームらしいと推定できたことです。

以上のように、高圧凍結された厚い試料のクライオ蛍光イメージングによって、過渡的な細胞構造を、生理的環境下に近い状態で捉えて画像化できます。さらに適切な試料処理と相関EMボリュームイメージングを施すことで、当該標的構造の高分解能3次元再構成を達成することができます。

データご提供:Kedar Narayan, National Cancer Institute / NIH and Frederick National Laboratory for Cancer Research, USA

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    • ZEISS Correlative Cryo Workflow

      Your Solution for TEM Lamella Preparation and Volume Imaging under Cryogenic Conditions

      ページ: 31
      ファイルサイズ: 7 MB

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