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Anwendungen für Array Tomography

Inspirierende Beispiele entdecken

Die Array-Tomografie (AT) ist für die Erzeugung von 3D-Datensätzen mit einer Auflösung im Nanobereich besonders gut geeignet. Die Probe wird in Hunderte einzelne Schnitte zerlegt und jeder Schnitt per Rasterelektronenmikroskopie in hoher Auflösung abgebildet.

Bei dieser zerstörungsfreien Methode bleiben die Dünnschliffe der Probe auf dem Imaging-Substrat erhalten und können mit anderen Methoden wie Fluoreszenzmikroskopie und weiteren Analyseverfahren eingehender untersucht werden.

Eine besondere Ausstattung ist nicht erforderlich. Damit steht dieser Volumen-EM-Ansatz (vEM) jedem Labor mit Standard-Rasterelektronenmikroskop (SEM) und Ultramikrotom offen. Diese Merkmale machen die AT zu einem wertvollen Hilfsmittel bei der Untersuchung verschiedenster Proben – von Zellen über Gewebe bis hin zu ganzen Pflanzen, wie diese Beispiele veranschaulichen.

Verbindungen in Hirngewebe

Millionen neuronaler Verbindungen untersuchen und die Signalwege im Gehirn besser nachvollziehen.

Übersichtsbild eines Affenhirns, aufgenommen mit AT.

Das Gehirn ist ein komplexes Organ mit Millionen von neuronalen Verbindungen und Signalwegen. Mit einem besseren Verständnis des Zusammenhangs zwischen Struktur und Funktion des neuronalen Gewebes lässt sich diese Komplexität leichter nachvollziehen und genauer bestimmen, wie das Gehirn arbeitet, damit (auf lange Sicht) Funktionsstörungen mit medizinischen Interventionen behandelt werden können.

Hochaufgelöstes Bild eines Affenhirns, aufgenommen mit SEM.

Wenn es gilt, Millionen neuronaler Verbindungen zu untersuchen, kommt es auf eine 3D-Bildgebung in hoher Auflösung an. Bei kleinen Gehirnpräparaten ist der Zeitaufwand für die Erfassung eines vollständigen 3D-Datensatzes zwar erheblich, aber noch machbar. Ist das Gehirnpräparat jedoch deutlich größer, beispielsweise beim Gehirn einer Maus oder eines Affen, muss das Imaging hochskaliert werden, um hochaufgelöste 3D-Datensätze in einem realistischen Zeitraum zu erzeugen. Genau hier kommt die AT ins Spiel.

Gefäßsystem im Gehirn eines Affen, aufgenommen mit AT.

Das Hardware-/Softwaretool ZEISS Atlas 5 Array Tomography nimmt automatisch Serienschnitte im Substrat auf, bis hin zu einer Auflösung im Nanometerbereich. Dieser einzigartige, anwenderfreundliche Workflow wurde speziell für die automatisierte Bildgebung entwickelt. Damit ist es möglich, die umfangreichen Volumina, mit denen sich die zahllosen Verbindungen im Hirngewebe nachvollziehen lassen, in 3D zu visualisieren.

Automatische Bildaufnahme des Gefäßsystems im Affenhirn, in großem Maßstab. Bild aufgenommen mit Atlas 5 Array Tomography. Sehfeld: 3700 mm.

Mosaik aus > 1.000 Bildern des Affenhirns. Jedes Kachelbild ist 4.096 × 4.096 Pixel groß (Pixelgröße 150 nm).

Automatisiertes Stitching dieser Kachelbilder zur Erstellung eines einzigen Bilds des Affenhirns mit großem Sehfeld.

Ultradünnschnitt eines Mäusehirns — Ultradünnschnitt eines Mäusegehirns. Probe mit freundlicher Genehmigung von J. Lichtman, Harvard University, USA.

Mit den computergestützten Tools in Atlas 5 Array Tomography können Sie über Hunderte von Serienschnitten hinweg unbegrenzt Zielbereiche beliebiger Form definieren. Das ist von besonderem Nutzen bei Versuchen wie der Erfassung eines Affengehirns oder den neuronalen Verbindungen im Mäusegehirn.

Dieses SEM-Bild zeigt einen Ultradünnschnitt eines Mäusehirns in großem Maßstab, eingebettet in ein Substrat. Das Bild wurde mit Atlas 5 Array Tomography aufgenommen, um die Automatisierung der Bildaufnahme zu unterstützen.

Es lassen sich subzelluläre Details wie der Zellkern und die Mitochondrien identifizieren. Bei der Rekonstruktion in 3D ist es möglich, die Verbindungen zwischen den einzelnen Neuronen darzustellen.

Dieses Bild zeigt eine Reihe von Gehirnschnitten auf einer Trägerfolie, die für die Bildaufnahme bereitliegen. Atlas 5 Array Tomography identifiziert die einzelnen Kleinhirnbereiche für die nachfolgende SEM-Aufnahme in hoher Auflösung. Alle nützlichen Informationen zu den einzelnen Schnitten werden auf der Softwareplattform gespeichert.

Ultradünnschnitt eines Mäusegehirns. Probe mit freundlicher Genehmigung von J. Lichtman, Harvard University, USA.

Dieses Video zeigt den großen Nutzen von Atlas 5 Array Tomography für die Optimierung Ihrer AT-Workflows. Im Verlauf des Videos sehen Sie, wie die hochaufgelösten Daten zu den einzelnen Schnitten aufgenommen und abschließend zu einem 3D-Datensatz zusammengeführt werden.

Für die hochaufgelöste SEM-Erfassung des Sehnervs müssen einzelne Schnitte abgebildet und dann rekonstruiert werden. Diese Schnitte werden per Array Tomography automatisch lokalisiert und nachfolgend abgebildet. Die Bildaufnahme wird auf diese Weise deutlich beschleunigt und vereinfacht.

Das Bild zeigt die einzelnen Schnitte des Sehnervs, fixiert auf einem Wafer und bereit für die Bildgebung mit der Atlas 5 Software.

Sehnerv einer Maus, abgebildet mit Array-Tomografie. Probe mit freundlicher Genehmigung von J. Lichtman, Harvard University, USA.

Für die Bildgebung eines Gehirns per Array Tomography sind Hunderte und manchmal Tausende von Schnitten nötig, die lokalisiert und abgebildet werden müssen. Die manuelle Identifizierung der einzelnen Schnitte ist mühsam und zeitraubend. Atlas 5 identifiziert die einzelnen Schnitte schnell und automatisch. So kann sich die Bildgebung schnell und effizient anschließen. Alle hochaufgelösten Daten werden in der Software erfasst.

Auswirkungen von Bakterien in Wurzelknöllchen auf die Gesundheit und den Zustand von Pflanzen

Die Wurzelknöllchen- und Bakterienverteilung durch Überlagerung von Fluoreszenz- und Strukturdaten mittels Correlative Array Tomography (CAT) visualisieren.

Wurzelknöllchen mit Darstellung der Plasmodesmenverteilung. Mit freundlicher Genehmigung von D. Sherrier, J. Caplan und S. Modla, University of Delaware, USA.

Über ihr Wurzelnetzwerk erhält eine Pflanze das Wasser und alle Nährstoffe, die für ihr Wachstum unverzichtbar sind. Sollen die Pflanzengesundheit und der Ertrag optimiert werden, gilt es, das gesamte Wurzelnetzwerk zu untersuchen und den Einfluss externer Mikroben nachzuvollziehen.

Für eine Untersuchung der Symbiose zwischen Pflanzen und Bakterien in Wurzelknöllchen muss die Wurzelknöllchen- und Bakterienverteilung bekannt sein. Dieser Punkt lässt sich nur mit einer Kombination aus Fluoreszenz und hochaufgelöster Strukturbeurteilung detailliert ermitteln.

Die korrelative Array-Tomografie ermöglicht die Überlagerung von Fluoreszenz- und Strukturdaten, wodurch die Wurzelknöllchen- und Bakterienverteilung anschaulich visualisiert wird.

Die Kombination hochaufgelöster Strukturdaten und präziser Fluoreszenzdaten ist der Schlüssel zum Verständnis, wie die Bakterien in den Wurzelknöllchen den Zustand der Pflanze beeinflussen.

Wurzelknöllchen mit Darstellung der Plasmodesmenverteilung. Mit freundlicher Genehmigung von D. Sherrier, J. Caplan und S. Modla, University of Delaware, USA.

Die Bilder sind entweder 3D-Rekonstruktionen oder Einzelschnitte mit Fluoreszenzdaten aus Serienschnitten von Wurzelknöllchen mit Darstellung der Plasmodesmenverteilung. Die Ebenen können mit den SEM-Daten überlagert werden, um den Zusammenhang von Bakterieninfektionen und Plasmodesmenverteilung zu untersuchen.

Die Probe wurde in Epon eingebettet und mit einem Ultramikrotom geschnitten. Die Serienschnitte wurden mithilfe eines Mikromanipulators auf ITO-beschichtete Deckgläser transferiert. Die Zellwände wurden mit Calcofluor White (blau) gefärbt, die Plasmodesmen wurden auf Callose mit Alexa Fluor 647 gefärbt. Die Probe wurde für die SEM-Bildgebung nachgefärbt.

Einrichtung einer Array Tomography Aufnahme

Dieses Video zeigt den Arbeitsablauf in ZEISS Atlas 5 Array Tomography, mit dem ein korrelativer Datensatz mit Fluoreszenz- und SEM-Daten erzeugt wird. Die entsprechende Konfiguration wird im Video am Beispiel einer Hefeprobe veranschaulicht.

Die im Video gezeigte Hefeprobe wurde in Epon eingebettet und mit einem Ultramikrotom geschnitten. Die Serienschnitte wurden mithilfe eines Mikromanipulators auf ITO-beschichtete Deckgläser transferiert. Die Probe wurde zunächst mit dem Lichtmikroskop abgebildet und dann für die SEM-Bildgebung nachgefärbt.

Mit freundlicher Genehmigung von D. Sherrier, J. Caplan und S. Modla, University of Delaware, USA.

Biologie und Progression der Chorea Huntington

Die Entwicklung von Proteinplaques in Makrophagen mittels Correlative Array Tomography (CAT) visualisieren.

Makrophagen mit Proteinplaques, induziert durch Aggregation des mutierten Huntingtin-Proteins. Das Bild zeigt einen Fluoreszenzdatensatz aus einem einzelnen Schnitt mit Proteinplaques in den Makrophagen. DNA: blau (DAPI), Huntingtin-Protein: rot (Alexa Fluor 647). Mit freundlicher Genehmigung von Jeff Caplan, University of Delaware, USA.

Die Chorea Huntington ist eine unheilbare progressive neurodegenerative Erkrankung, die durch ein defektes Gen auf Chromosom 4 verursacht wird, das für das Huntingtin-Protein kodiert. Das defekte Gen führt zur Bildung von mutiertem Huntingtin-Protein, das sich fehlfaltet und aggregiert, wodurch Plaques im Gehirn entstehen. Eine solche Schädigung im Gehirn führt zu Störungen der Bewegung, des Verhaltens, des Denkens und der Emotionen.

Eine Überexpression von Huntingtin führt zu einer Aggregation des Proteins, die in den Z-Ebenen deutlich sichtbar ist. Es wurde ein Antikörper gegen GFP-Huntington eingesetzt, um Huntingtin-Plaques in den Zellen zu lokalisieren (Alexa Fluor 647, rot). Der Zellkern ist blau dargestellt (Hoechst). Die Korrelation der LM-Z-Ebenen mit den SEM-Z-Ebenen zeigt die Verteilung der Huntingtin-Plaques und die Position des Zellkerns in 3D. Mit freundlicher Genehmigung von J. Caplan, E. Kmiec und S. Modla, University of Delaware, USA.

Die Visualisierung der Entstehung von Proteinplaques in Makrophagen, die als Modellsystem für die Untersuchung dieser Erkrankung dienen, und die Einblicke in die Zusammenhänge mit der Ultrastruktur der Zelle sind der Schlüssel für das Verständnis der Biologie und Progression der Chorea Huntington.

Correlative Array Tomography eröffnet die Möglichkeit, sowohl Ultrastrukturdaten als auch Fluoreszenzdaten aus Serienschnitten dieses Makrophagen zu untersuchen.

Die Korrelation der LM-Z-Ebenen mit den SEM-Z-Ebenen zeigt die Verteilung der Huntingtin-Plaques und die Position des Zellkerns in 3D. Mit freundlicher Genehmigung von J. Caplan, E. Kmiec und S. Modla, University of Delaware, USA.

Die Korrelation der hochaufgelösten Ultrastruktur- und Fluoreszenzdaten ist unerlässlich, um die Biologie und die Progression der Chorea Huntington nachzuvollziehen.

Das nebenstehende Bild zeigt eine schematische Darstellung der Daten in 3D, die durch eine Kombination der LM- und SEM-Serienbilder der Makrophagen erstellt wurde. Die Serienbilder sind Ergebnis eines Versuchs mit ZEISS ZEN Correlative Array Tomography und zeigen Makrophagen, die das Huntingtin-Protein exprimieren.

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Array Tomography Verfahren

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Volumen-EM-Verfahren – Überblick

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E-Book | From 3D Light to 3D Electron Microscopy

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